فك رموز محواري مقررات تمهيدية للمجموعات المحددة وراثيا من الخلايا العصبية في الأنبوبة العصبية الاستفادة الفرخ في البيضة Electroporation
May 2nd, 2010
هذا الفيديو يوضح كيفية تصور مسارات محواري مجموعات محددة وراثيا من الخلايا العصبية في النخاع الشوكي باستخدام الفرخ الجنينية في البيضة electroporation الجينات مراسل تحت سيطرة عناصر محسن محددة.
مرحبا ، أنا هام من مختبر الدكتور ريفيو كلار في قسم البيولوجيا العصبية الطبية في الجامعة العبرية في القدس. مرحبا ، أنا صوفي إسمان وأنا أيضا من مختبر لارس. سنعرض لك اليوم إجراء ل Innovo ، التثقيب الكهربائي وإعداد الكتاب المفتوح للحبل الشوكي.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة المسارات المحورية لمجموعة الخلايا العصبية المحددة وراثيا في الحبل الشوكي الجنيني. لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، انقل بيض الدجاج الأبيض المخصب من درجة حرارة الغرفة إلى حاضنة رطبة ، ويفضل أن يكون ذلك باستخدام صواني هزاز عند 37 إلى 38 درجة مئوية.
من المهم مراقبة درجة حرارة ورطوبة الحاضنة من أجل الحصول على أجنة قابلة للحياة ومتزامنة. يتم تزويد أجنة الكتاكيت بالكهرباء عندما تصل إلى مرحلة الهامبرغر وهاميلتون أو HH من 18 إلى 20 ، وهي مرحلة مثالية للتعبير المحدد عن الاعتماد على المحسن. في هذه المرحلة ، يقع الرأس في زوايا قائمة على الجذع.
أيضا في المرحلة السمو الملكي من 18 إلى 20 ، يجب أيضا رؤية مجموعة واسعة من الأوعية الدموية الجنينية الإضافية مثل الأوعية الحيوية الأمامية والخلفية اليمنى واليسرى. تصل أجنة الكتاكيت إلى مرحلة HH من 19 إلى 20 بعد 66 ساعة من الحضانة ، وفي ذلك الوقت قم بإزالة البيض من الحاضنة بعد إزالة البيض ، ضعه أفقيا وانتظر لمدة خمس إلى 10 دقائق. يقع الجنين الآن في القطب العلوي للبويضة.
قبل البكتيريا الكهربائية ، تقوم الأجنة بإعداد محلول هانك ب 100 وحدة لكل مليلتر من البنسلين و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. قم بإعداد خليط مرغوب فيه من الحمض النووي بمعدل ميكروغرام إلى خمسة ميكروغرام لكل ميكرولتر وأضف بضع حبيبات من الصبغة الخضراء السريعة لسهولة تصور الحمض النووي المحقون. جهز أيضا ماصة الفم وإبرة حقنة معقمة ومقص صغير وشريط لاصق.
قم بإعداد الشعيرات الدموية الدقيقة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية بقطر 0.5 مم باستخدام مجتذب الماصة. ضع أقطاب التنغستن في المعالجات الدقيقة وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد النبض. اضبط الجهد على مولد النبض على 30 فولت تحت الصفر ، وطول كل نبضة إلى 50 مللي ثانية ، وعدد النبضات على ثلاثة.
انتقل إلى التثقيب الكهربائي قبل تعريض الأجنة والتعامل معها. أدخل حقنة في القطب الضيق للبيضة وقم بإزالة خمسة إلى ستة ملليلتر من الألبومين من كل بيضة. تتم إزالة الألبومين لتجنب انسكابه.
عند قص الخطوة التالية ، استخدم المقص الصغير للقطع. افتح نافذة بيضاوية في الجانب العلوي من البيضة بعد الكشف عن جنين الفرخ ، وقم بترطيبها ب 0.5 إلى مل واحد من محلول الهانكس والبنسلين ستربتومايسين. بعد ذلك ، استخدم بربيت الفم لتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية الصغيرة.
باستخدام خليط صبغة الحمض النووي ، يجب تحميل الشعيرات الدموية الدقيقة ذات القطر الصحيح بسهولة مع الحمض النووي. تحت وضع مجهر ، يتم حقن الحمض النووي في الأنبوب العصبي. ضع الجنين وذيله نحوك.
في هذه المرحلة التنموية ، يكون الحبل الشوكي مرئيا بوضوح وبالتالي لا يلزم وجود تقنيات متباينة. يتم إغلاق الحبل الشوكي في كل من الرأس ونهاية الذيل. ومع ذلك ، مع ثقوب الشعيرات الدموية الدقيقة المزيد من الثقوب في الأنبوب العصبي واختراقه بزاوية ضحلة ، يجب أن تخترق الشعيرات الدموية الدقيقة الرقيقة بدرجة كافية والقطر الصحيح الأنبوب دون إتلافه.
حقن الحمض النووي باستخدام الفم. يجب أن تطلق الشعيرات الدموية الدقيقة ذات القطر الصحيح الحمض النووي مع الزفير المنتظم. يجب أن تنتشر الصبغة الخضراء من طرف الذيل إلى حويصلات الدماغ النامي.
الحقن حتى يمتلئ الأنبوب العصبي بالحمض النووي الكهربائي مطلوب للحمض النووي المحقون لدخول الخلايا أولا. ضع الأقطاب الكهربائية بالتوازي مع الأنبوب العصبي وبالقرب منه قدر الإمكان دون لمس الأنبوب نفسه. تأكد من تغطية الأقطاب الكهربائية بالسائل للسماح بالتوصيل الكهربائي أثناء النبض.
عادة ما يكون محلول هانك المضاف مباشرة بعد تعريض الجنين كافيا. ولكن إذا لم تكن قطرة واحدة من محلول هانك قبل النبضة مباشرة مع وضع الأقطاب الكهربائية وغمرها في نبضة سائلة لتشغيلها كهربائيا ، فقم بإزالة الأقطاب الكهربائية بعناية وأغلق النافذة والبيضة بشريط لاصق. من المهم إغلاق البويضة تماما لمنع جفاف الجنين خلال فترة الحضانة التالية.
ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة واحتضنها حتى يصل جنين الفرخ إلى التطور الجنيني. اليوم السادس أو E السادس ، عندما يحين وقت التصوير عندما يصل الجنين الكهربائي إلى الجنين التطوري. اليوم السادس ، E بعد ستة أيام من التثقيب الكهربائي ، أخرجه من البيضة وضعه في طبق بتري مطلي بالسيليكون يحتوي على PBS باستخدام مقص ناعم.
اقطع الأغشية وقم بتمديد الجنين على جانبه البطني باستخدام دبابيس مضغوطة في السيليكون لتثبيته في مكانه. باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة التنغستن الحادة. قم بعمل شق طولي على طول لوحة السقف من الدماغ الخلفي إلى الذيل.
قم بعمل شقين طوليين إضافيين على جانبي الحبل الشوكي ، وفصل العقد الجذرية الظهرية أو DRGs عن الحبل الشوكي. افصل صفيحة الأرضية عن الأنسجة بدءا من الذيل إلى الدماغ الخلفي ، مع ترك الحبل الشوكي سليما. أخيرا ، استخدم مقصا دقيقا لقطع الحبل الشوكي في مقطع عرضي في الدماغ الخلفي وفصل الحبل الشوكي عن الجسم.
الآن بعد أن تم عزل الحبل الشوكي ، انشره في طبق بتري جديد مطلي بالسيليكون يحتوي على PBS باستخدام دبابيس لتثبيته من الدماغ الخلفي إلى الذيل مما ينتج عنه مستحضر مسطح. قم بتثبيت الحبل الشوكي في 4٪ بارالديهايد في PBS لمدة ساعة واحدة في صبغة مناعية بدرجة حرارة الغرفة بعد إجراء الكيمياء المناعية ، والبروتوكول المكتوب المفصل والمصاحب لتركيب الحبل الشوكي مفتوحا. إعداد الكتاب للتصوير.
انشر الشحوم أو السيليكون على شكل مستطيل على شريحة وقم بتقطير PBS داخل المستطيل. استخدم الملقط لوضع الحبل الشوكي ، وشد منتصف المستطيل واسحب السائل من حوله. مع المعكرونة لكل أليف ، ضع قطرة أو قطرتين من وسائط التثبيت على الحبل الشوكي وقم بتغطيتها بقلة غطاء.
اضغط على زلة الغطاء. لتجنب فقاعات الهواء. حافظ على الشرائح في الظلام في أربع درجات مئوية.
فحص الحبل الشوكي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. فيما يلي بعض النتائج التمثيلية للرفض المحوري للخلايا العصبية بين العمود الفقري للكتكوت في تجارب التحكم حيث يتم التعبير عن RFP في جميع الخلايا العصبية التي تستخدم عنصر محسن في كل مكان من CMV ، ويتم تصنيف معظم الخلايا العصبية وأكوامرها. من المستحيل فك تشفير المسار المحوري للمجموعات السكانية الفرعية العصبية.
ومع ذلك ، عند تطبيق عناصر معززة محددة ، يتم الكشف عن مسار محوري محدد لمجموعة سكانية فرعية معينة DI خليتين عصبيتين في هذا المثال. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تشغيل أنبوب عصبي للخد كهربائيا باستخدام محسن عصبي محدد في E ثلاثة وكيفية تحضير كتاب مفتوح للحبل الشوكي في E ستة. عند القيام بهذا الإجراء ، يجب أن تتذكر توخي الحذر والصبر.
هذا هو. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك. حظ سعيد.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُظهر هذا الفيديو إجراءً لتصور مسارات المحاور العصبية للخلايا العصبية المحددة وراثيًا في الحبل الشوكي للجنين باستخدام التوصيل الكهربائي داخل البيضة. تتيح هذه الطريقة للباحثين دراسة مسارات المحاور العصبية بشكل فعال.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- الفيزيولوجيا الكهربية
الخلفية
- فهم مسارات المحاور العصبية أمر بالغ الأهمية لأبحاث علم الأعصاب.
- التوصيل الكهربائي داخل البيضة هو تقنية تُستخدم لإدخال جينات التقارير.
- يُستخدم الحبل الشوكي للجنين كنموذج لدراسة تطور الخلايا العصبية.
- يمكن أن توفر المجموعات العصبية المحددة وراثيًا رؤى حول الدوائر العصبية المحددة.
هدف الدراسة
- تصور مسارات المحاور العصبية في الحبل الشوكي للجنين.
- استخدام التوصيل الكهربائي داخل البيضة لدراسات التعبير الجيني.
- تعزيز فهم تطور الخلايا العصبية وتواصلها.
الطرق المستخدمة
- نقل بيض الدجاج المخصب إلى حاضنة مبللة.
- الحفاظ على الحضانة عند 37 إلى 38 درجة مئوية.
- إجراء التوصيل الكهربائي داخل البيضة لإدخال جينات التقارير.
- إعداد المستحضرات المفتوحة للحبل الشوكي للتصور.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لمسارات المحاور العصبية في الحبل الشوكي.
- تبيان فعالية التوصيل الكهربائي داخل البيضة.
- رؤى حول مسارات المجموعات العصبية المحددة وراثيًا.
- تأسيس طريقة موثوقة لدراسة تطور الخلايا العصبية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أداة قيّمة لأبحاث علم الأعصاب.
- التوصيل الكهربائي داخل البيضة فعال لتوصيل الجينات في النماذج الجنينية.
- يمكن أن يساعد فهم مسارات المحاور العصبية في دراسة تكوين الدوائر العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
