عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

للربط المتقاطع ، يليه الترسيب المناعي. يتم تحضين خلايا الإجراء بكثافة 80 إلى 90٪ بثلج بارد واحد ملليمول. DSP في PBS أو الكالسيوم أو المغنيسيوم أو DMSO فقط.

التحكم في السيارة. DSP عبارة عن غشاء ثنائي الوظيفة قابل للاختراق وقابل للاختزال ومتشابك متشابك مجاني ويعني في حدود 12 أنجستروم من بعضها البعض. يتم تحلل الخلايا المتشابكة التالية ويتم إجراء الترسبات المناعية باستخدام الضوابط القياسية.

ثم يتم حل مجمعات البروتين عن طريق تقليل صفحة SDS ، وتقليل DSP المشقوق للعوامل ، مما يسمح بتحديد البروتينات الفردية عن طريق اللطخة المناعية. مرحبا ، أنا ستيفاني إيك من مختبر الدكتور فيكتور فوندي في قسم بيولوجيا الخلية بجامعة إيموري. وأنا بيرل رايدر ، أيضا من مختبر فوندي.

سنعرض لك اليوم إجراء لعزل مجمعات myprotein باستخدام الربط المتقاطع المتحكم فيه متبوعا بكروماتوغرافيا التقارب المغناطيسي المناعي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تفاعلات البروتين المتقلب العابرة. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ بتسمية الجزء السفلي من لوحات الخلية للإشارة إلى نوع الخلية والحالة التجريبية المحددة. يشير الرمز الموجب هنا إلى أن DSP المعالج يتضمن التحكم في السيارة DMSO السلبي فقط. أضف وسائط إلى الألواح لإعدادها للوحة بذر الخلايا.

يتم زرع خلايا HEK في تخفيف واحد إلى خمسة للسماح بعزل 500 ميكروغرام من البروتين لكل تفاعل أنبوبي قياسي. قد يكون أنبوب واحد كافيا لتحديد شركاء الربط المفترض لبروتين ذي أهمية عن طريق اللطخة المناعية من تحليل قياس الطيف الكتلي. زيادة عدد التفاعلات القياسية 10 مرات على الأقل.

قم أيضا بإعداد سيقان لمعظم الحلول المستخدمة في تجربة الربط المتقاطع. وتشمل هذه البرامج PBS المكمل ب 0.1 مللي مولار كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم المليمولار يسمى PBS الكالسيوم المغنيسيوم. تعد إضافة أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم أمرا بالغ الأهمية لالتصاق الخلايا بلوحة الزاعقة.

أثناء التجربة ، قم بتخزين المحلول عند أربع درجات مئوية. تشمل الأسهم الأخرى محلول تبريد الرابط المتقاطع 50 × كوكتيل مثبط البروتياز الكامل ، وهو دوامة كل 20 دقيقة حتى تذوب الحبيبات. 20٪ Tritan X 100 ، والتي يتم تخزينها عند أربع درجات مئوية ويجب استخدامها في غضون شهر واحد و 10 × وواحد × Buffer a.

قم بإعداد وتخزين جميع الحلول كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب المصاحب. أخيرا ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل المكون من مخزن مؤقت X واحد. زائد 0.5٪ TRITTON X 100 ومخزن مؤقت لهطول الأمطار المغناطيسي المناعي أو مخزن IP يتكون من مخزن مؤقت X واحد.

A زائد 0.1٪ TRITTON X 101 بعد يومين من الطلاء ، تكون الخلايا من 80 إلى 90٪ طلاقة مشتركة ، وهو مثالي للربط المتبادل. في ظروف الطلاقة العالية ، تميل الخلايا إلى التراكم على بعضها البعض مما يؤدي إلى انخفاض إمكانية الوصول إلى الرابط المتقاطع القابل للاختراق للخلية لجميع الخلايا. ضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة حتى تصبح جاهزة للتشابك.

قم بإعداد محلول DSP Crosslinker مباشرة قبل تطبيقه على الخلايا. DSP شديد المقاومة للماء وبالتالي يتم إذابته في DMSO بتركيز 100 مللي مولار قبل تخفيفه في مخزن مغنيسيوم الكالسيوم PBS. لزيادة تعزيز تخفيف DSP في المخزن المؤقت للمغنيسيوم الكالسيوم PBS ، الحجم الدافئ والمناسب ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون DSP و DMSO.

لكل مليلتر واحد من مغنيسيوم الكالسيوم الدافئ PBS ، أضف محلول مخزون D-S-P-D-M-S-O قطرة قطرة مع الخلط المتكرر حتى يذوب كل DSP. أيضا ، قم بإعداد محلول التحكم في السيارة من 10 ميكرولتر من DMSO لكل مليلتر من مغنيسيوم الكالسيوم PBS. بعد تخفيف DSP ، احتفظ بجميع محاليل الكالسيوم المغنيسيوم PBS في حمام ماء مثلج لمدة لا تزيد عن 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإعداد حمام ماء مثلج يحتوي على جميع الأطباق المستخدمة في التجربة. استمر في أخذ لوحات الثقافة التي تحتوي على الخلايا من حاضنة 37 درجة مئوية وضعها على الفور في حمام الماء المثلج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام المغنيسيوم الكالسيوم PBS المثلج البارد ، باستخدام نفس الأحجام المعدة مسبقا للحضانة باستخدام الرابط المتقاطع لستة ، ولوحة جيدة تحسب ملليلترين لكل بئر وما إلى ذلك.

بعد الغسيل الثاني. أضف إما التحكم في السيارة ، وهو DMSO المذاب في المخزن المؤقت أو محلول المخزن المؤقت DSP المتشابك إلى الخلايا التي تحتضن على الجليد لمدة ساعتين وتحقق كل 20 دقيقة تقريبا للتأكد من أن جميع الخلايا مغطاة بالمحلول. إذا تعرضت بعض الخلايا ، فقم بقلب الطبق وتدويره لتغطيتها بالتساوي مرة أخرى ، فمن الطبيعي أن تترسب كمية صغيرة من DSP.

خلال الحضانة لمدة ساعتين مع الخلايا قبل انتهاء الحضانة لمدة ساعتين ، قم بإعداد محلول تبريد XDSP واحد عن طريق تخفيف الساق إلى مغنيسيوم الكالسيوم PBS. احتفظ بالمحلول على الجليد حتى استخدامه لإيقاف تفاعل الربط المتقاطع عن طريق تعطيل DSP الذي لم يتفاعل. عندما تنتهي الساعتين ، قم بإزالة حلول التحكم في السيارة والربط المتقاطع من الخلايا.

أضف محلول التبريد المثلج DSP واحتضنه على الثلج لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف مخزون كوكتيل مثبط البروتياز الكامل من واحد إلى 50 في المخزن المؤقت لتحلل الخلية. بمجرد انتهاء ال 15 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الكالسيوم المغنيسيوم.

ثم أضف مخزن التحلل الذي يحتوي على مثبطات الإنزيم البروتيني إلى الخلايا والصخور عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة من تحلل الخلية ، استخدم مكشطة الخلايا لجمع الخلايا من اللوحة. تأكد من إبقاء المحللات على الجليد لتقليل نشاط البروتياز.

قم بتدوير الخلية المحللة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة بسرعة قصوى تبلغ 15 ، 000 Gs.Pipette المادة الطافية في أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. قم بتحليل مستويات البروتين باستخدام مقايسة برادفورد واستمر في الترسيب المناعي. ابدأ في التحضير للترسيب المناعي فور بدء تفاعل الربط المتقاطع لمدة ساعتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات اللولب اللولبي.

اجمع بين 30 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية المناعية المضادة ل IgG مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP. أضف الجسم المضاد مقابل الهدف محل الاهتمام. يجب تحديد الكمية المناسبة من الجسم المضاد لكل مستضد على حدة.

في التجارب الأولية ، لا تتضمن الضوابط السلبية المحتملة للخرز أي أجسام مضادة وخرز وخرز الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل لربط الجسم المضاد IP بالخرز المغناطيسي. احتضان في هزاز نهاية نهاية نهاية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في نهاية الحضانة ، قم بتدوير الأنابيب بسرعة وحركها في الحامل المغناطيسي. سوف تتركز الخرزات على جانب المغناطيس.

قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على أجسام مضادة غير مرتبطة واغسل الخرزات على الفور لمنعها من الجفاف. بعد غسلتين ، أضف 500 ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل مليلتر من محللة الخلية السالبة DSP أو DSP الموجبة إلى الأنابيب المناسبة. يمكن تحضير التحكم السلبي في منافسة الببتيد في هذه المرحلة عن طريق إضافة الببتيد المناعي بتركيز محدد في التجارب الأولية إلى مزيج حبة المحللة.

عنصر تحكم سلبي آخر محتمل تم إعداده في هذه المرحلة هو المخزن المؤقت فقط أو تفاعل الحر المحلل الذي يتم إعداده عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل فقط إلى الخرز. أعد تعليق الخرز برفق للتفاعلات التجريبية والسيطرة. لا تقم بالدوامة لأن هذا سيؤدي إلى تحتضن الخرزات عند أربع درجات مع دوران نهاية على طرف لمدة ساعتين.

في نهاية ساعتين ، قم بإزالة المحللة باستخدام الحامل المغناطيسي. قم بتدوير سريع وغسل الخرزات ليصبح المجموع ست مرات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت IP. احتضان كل غسلة على أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

لتفادي المجمعات المرتبطة ، أضف عازلة عينة هلام x واحدة إلى أنبوب IP فوق حبيبات الخرزة مباشرة. لتجميع الخرزات في الجزء السفلي من الأنبوب ، اضغط برفق على الجزء السفلي من الأنبوب لإعادة تعليق جميع الخرزات في المخزن المؤقت لعينة الجل. بدلا من ذلك ، لعزل التقارب المناعي عند 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، مكمل بالببتيد المناعي للخرز.

يتم تحديد التركيز المطلوب للببتيد المناعي تجريبيا. بعد اختبار نطاق من 10 إلى 200 ميكرومولار ، احتضان الخرزات بأربع درجات لمدة ساعتين ، واضغط على الأنابيب كل 30 دقيقة. استخدم الحامل المغناطيسي لإزالة 30 ميكرولترا التي تحتوي على المجمعات المراوغة وحفظها في أنبوب نظيف بغسل باستخدام مخزن IP وحفظ الخرز.

أضف عازلة عينة هلام x إلى الخرزات لكلتا طريقتي الشطف. قم بتسخين الخرزات المغناطيسية المناعية المعلقة في عينة هلامية على حرارة 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بالإضافة إلى تغيير طبيعة البروتينات. ستعمل هذه الخطوة أيضا على تثبيت جزيء DSP مما يسمح بحل البروتينات الفردية في المدى المعقد.

العينات الموجودة على هلام صفحة SDS للنشاف الغربي. يمكن صد الخرزات المغناطيسية المناعية المفرغة عن طريق الطرد المركزي وإزالتها من العينة باستخدام حامل مغناطيسي قبل التحميل. إذا كان التقارب المناعي EUA خاليا من IgG عن طريق صبغة البروتين في صفحة SDS أو عن طريق البقع المناعية ، فهي مناسبة لقياس الطيف الكتلي.

فيما يلي مثال على لطخة غربية من مادة من محللة الخلايا المتشابكة وغير المتشابكة ، متبوعة بالترسيب المغناطيسي المناعي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة ضد الوحدة الفرعية الثلاثة AP. يسمح الربط المتقاطع دلتا باكتشاف البروتينات المتفاعلة التي لا تظهر في العينات غير المتشابكة أثناء العزلات المغناطيسية المناعية. أظهرت الضوابط السلبية عدم وجود بروتين معين ينسحب باستخدام التحكم المتطابق مع الأجسام المضادة والأجسام المضادة الخالية من الأجسام المضادة باستخدام IgG الموجه ضد مستقبل الترانسفيرين لكل من العينات غير المتشابكة والمتشابكة.

في هذا المثال ، تم استخدام شطف ببتيد التقارب لاستعادة البروتينات المرتبطة بالجسم المضاد IP. لاحظ أن الجسم المضاد المناعي غائب في الجزء السطحي ويبقى في جزء النبض أثناء شطف الببتيد. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل مجمعات MultiPro المتقابلة باستخدام DSP الكيميائي المتشابك ، متبوعا بتنقية التقارب المغناطيسي المناعي.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على محاليل الخلايا والمحاللات مبردة للحفاظ على تفاعلات متقابلة أثناء الربط المتبادل وتقليل نشاط البروتياز. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.