تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

في هذا الفيديو ، يتم إجراء فحص عالي المحتوى قائم على الصور لتقييم التعديل القائم على الجزيئات الصغيرة لعامل نمو الخلايا الليفية ، ومسار خريطة راسم كيناز في أجنة أسماك الزرد ، تتزاوج أنثى الزرد من الذكور والنوع البري المعدلة وراثيا في قفص تكاثر. يسقط البيض المخصب في القاع ويتم جمعه ونقله إلى طبق بتري. يتم تحضين الأجنة طوال الليل ، ثم توضع في آبار فردية من صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر.

يضاف الجزيء الصغير BCI لتنشيط إشارات FGF بشكل مفرط ويتم تحضين اللوحة لمدة ست ساعات. يتم التقاط الصور من كل وصية باستخدام قارئ لوحة متحد البؤر وتحليلها باستخدام خوارزمية مصممة ذاتيا تبلغ عن شدة الفلورسنت في هياكل جنينية محددة. مرحبا ، أنا هبة كادو من مختبر الدكتور مايكل تشانغ في قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة الجزيئية في جامعة بيتسبرغ.

مرحبا ، أنا أندريا سبوك من معهد اكتشاف الأدوية بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لك اليوم إجراءات تربية واختيار وترتيب أجنة أسماك الحمار الوحشي للمعالجة الكيميائية. في صفيحة 96 بئر ، سنستخدم الأجنة المعدلة وراثيا التي تبلغ عن أنشطة عامل نمو الألياف الزجاجية وتعالج بجزيء ينشط هذا اللون الأبيض الماضي.

سنوضح لك كيف نستخدم منهجية الفحص عالية المحتوى للحصول على نشاط عامل نمو الخلايا الليفية وتحليلها وتحديدها تلقائيا في أجنة أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا. سيسلط هذا الإجراء الضوء على تقنية المنصة لاستخدام أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا والشاشات الكيميائية عالية الإنتاجية. لذلك دعونا نبدأ.

قبل يومين من العلاج ، حدد ذكور الزرد المعدلة وراثيا متماثلة اللواقح وضعها في أحواض التزاوج الفردية. أضف الفواصل إلى الخزانات ، ثم أضف أنثى سمكة من النوع البري إلى كل حوض واترك السمكة في أقفاص التزاوج طوال الليل عند 28 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الفاصل بعد ساعة واحدة ، انقل السمكة إلى خزان جديد واسكب الأجنة في منخل بلاستيكي.

انقل الأجنة إلى أطباق 100 ملم بمحلول E ثلاثة واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات. بعد الحضانة ، افحص الأجنة تحت مجهر مجسم. ستخضع الأجنة المناسبة للتجارب للغازات.

في هذا الوقت ، قم بإزالة أي أجنة غير مخصبة ، والتي ستبقى في مرحلة الخلية الواحدة. أيضا ، قم بإزالة الأجنة غير القابلة للحياة التي تبدو معتمة أو مشوهة. ثم أضف محلول E الطازج الثلاثة واحتضنه طوال الليل عند 28 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، ضع الأجنة تحت مجهر استريو فلوري لفرز الأجنة المعدلة وراثيا لمرحلة مماثلة وموحدة. يظهر تعبير GFP 24 أجنة HPF حدود خلفية خلفية مرئية مع تعبير GFP مكثف وعيون جيدة التكوين مع شبكية ظهرية إيجابية GFP. هذه الأجنة نشطة وسوف تتحرك وتتأرجح في كوريونها باستخدام ماصة المراعي البلاستيكية.

انقل أجنة HPF البالغ عددها 24 جنة واحدة تلو الأخرى إلى آبار فردية من صفيحة 96 بئر. باستخدام ماصة صغيرة ، قم بإزالة أي محلول زائد من الثلاثة E من الآبار. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 200 ميكرولتر من محلول E ثلاثة إلى كل بئر.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من DMSO إلى جميع الآبار في العمودين الأول و 12. ثم أضف ميكرولترين من BCL المحضر في DMSO على النحو التالي ، واحد ، ميكرومولار إلى العمودين الثاني والسابع. خمسة ميكرومولار إلى ثلاثة وثمانية ، 10 ميكرومولار إلى أربعة وتسعة 20.

ميكرومولار إلى العمودين الخامس و 10. وأخيرا 25 ميكرومولار إلى العمود السادس و 11. الآن قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها لمدة ست ساعات عند 28 درجة مئوية.

أضف 10 ميكرولترات من trica إلى كل بئر لتخدير أجنة HPF البالغ عددها 30 جنة. ثم قم بتحميل اللوحة في الأجهزة الجزيئية ، وصورة التعبير عن برنامج التعبير التعريفي المفتوح للغاية. اختر تكوينا مع هدف فوركس وأقصى قطر ثقب.

قم بتكوين التركيز البؤري التلقائي بالليزر لاكتشاف قاع اللوحة واستخدام إزاحة Z مثالية محددة مسبقا. لاكتشاف مناطق الاهتمام، قم بتعيين منطقة الفحص كموقع واحد بحجم 2000 × 2000 بكسل بدون تثبيت. حدد نوع اللوحة المناسب وليزر الأرجون 488 نانومتر عند الإثارة على أطوال موجات الانبعاث 488 على 525 نانومتر.

ثم حدد بئرا تحتوي على جنين معالج بالسيارة وانقر فوق البحث عن عينة. ستقوم الأداة بإجراء مسح تركيز تلقائي والحصول على صورة واحدة لتأكيد الحصول على الصورة بشكل صحيح. اختر بشكل عشوائي سيارة تعامل جيدا واحصل على صورة.

إذا كانت الصورة في التركيز وتظهر تعبير GFP في الرأس. ضع المؤشر فوق المناطق الأكثر سطوعا وتحقق من أن شدة التألق ضمن نطاق الكاميرا 16 بت. أقل من 65 ، 000 وحدة.

كرر هذه الخطوات مع عنصر تحكم آخر في السيارة وعدد قليل من الآبار المعالجة المركبة. إذا لزم الأمر ، اضبط طاقة الليزر واكتساب بحيث لا تشبع المناطق الأكثر سطوعا في صور التحكم الإيجابية. بعد ذلك في نافذة الحصول على اللوحة والتحكم فيها ، اختر الحصول على لوحة لبدء مسح اللوحة.

ستحصل الأداة تلقائيا على صورة واحدة لكل بئر لللوحة الدقيقة بأكملها وأرشفتها في قاعدة بيانات خادم SQL. بمجرد انتهاء الفحص ، قم بتحميل الصور في التعريف D. المطور عن طريق فتح المطور مع تمكين خيار القاذف.

إنشاء مساحة عمل جديدة. ثم من قائمة الملف، حدد استيراد مخصص. بعد ذلك ، انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور وافتح نموذجا للملف.

اختر مرشح استيراد يتعرف على تنسيق الصورة وبنية الملف التي تم إنشاؤها بواسطة النظام الأساسي الفائق للصور الفائقة للأجهزة الجزيئية. الآن لمعالجة الصور ، افتح صورة تحكم وقم بتحميل تقنية شبكة الإدراك المطلوبة أو خوارزمية CNT أو مجموعة القواعد. تم تصميم الخوارزمية المخصصة المستخدمة هنا لتحديد الجنين والصفار والرأس تلقائيا ولتحديد سطوع ومساحة GFP التي تعبر عن هياكل الرأس ، وتنفيذ القواعد المحددة لمرحلة اكتشاف الرأس وصفار البيض.

لضمان التخصيص المناسب لكيس الصفار والرأس ، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة اكتشاف صفار البيض إذا كان صفار البيض كبيرا جدا أو صغيرا جدا. بعد ذلك ، قم بتنفيذ القاعدة التي تم تعيينها على مرحلة اكتشاف هياكل الرأس الساطعة. لضمان التخصيص الصحيح للمناطق التي تعبر عن GFP في الرأس ، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة الكشف عن هياكل الرأس كمضاعفات للشدة الوضيعة حتى يتطابق اكتشاف هياكل الرأس الساطعة مع الملاحظة البصرية.

بعد ذلك ، قم بتنفيذ مجموعة القواعد بأكملها يدويا على العديد من الصور المختارة عشوائيا التي تم إنشاؤها من الأجنة المعالجة بالمركبات وصور التحكم الإيجابية من الأجنة المعالجة ب PCI. لتشغيل الخوارزمية على جميع صور اللوحة ، حدد اللوحات لتحليلها واختيارها. قم بالتحليل ، ثم انتقل إلى مجموعة القواعد المحسنة وقم بتحليل جميع الآبار.

باستخدام جدولة الوظائف المدمجة ، سيتم استبعاد الآبار الفارغة أو الصور الغامضة تلقائيا من التحليل أثناء الفحص. يتم عرض خريطة الاحتفاظ التي يتم تحديثها باستمرار. يمكن الوصول إلى كل من البيانات والصور أثناء التشغيل للفحص البصري.

يتم حفظ البيانات الرقمية والصور المعالجة تلقائيا. بعد تحليل جميع الصور ، يمكن تصدير البيانات إلى برامج تابعة لجهات خارجية مثل Excel أو GraphPad أو المنشور. يوضح هذا الشكل صور مسح مؤرشفة من مركبة تمت معالجتها و BCI تعامل بشكل جيد مع وبدون تحليل CNT.

يتم الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر المطبق أو GFP في العين وحدود الدماغ الخلفي الأوسط والعقد ثلاثية التوائم للأجنة المعدلة وراثيا. لاحظ أنه يتم توسيع كل من كثافة GFP ومجالات التعبير. في الأجنة المعالجة BCI هنا ، يظهر تأثير يعتمد على جرعة BCI على التعبير الجيني لمراسل GFP في الأجنة المعدلة وراثيا.

التركيز المطلوب لاستنباط نصف استجابة قصوى أو EC 50 حوالي 12 ميكرومولار. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تربية وجمع وترتيب أجنة أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا في 96 لوحة بئر. لقد أضفنا تركيزا متزايدا من PCI في المنشط الخاص بمسار الإشارة.

لقد أظهرنا أيضا كيفية أتمتة تصوير الأجنة المعدلة وراثيا وقمنا بتحليل الصور باستخدام خوارزمية مصممة خصيصا تعتمد على تقنية شبكة الإدراك. باستخدام هذا النهج ، تمكنا من قياس تأثيرات منشط جزيئي صغير لإشارات عامل نمو الخلايا الليفية كميا ومتدرجة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار الأجنة بعناية لتقليل التباين بين العينات.

هذا هو. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.