تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

في هذا الفيديو، يتم إجراء فحص عالي المحتوى قائم على التصوير لتقييم تعديل الجزيئات الصغيرة لمسار كيناز خريطة الإشارة Ras map الخاص بعامل نمو الخلايا الليفية. في أجنة أسماك الزيبرا، يتم تزويج ذكور معدلة وراثياً وإناث من النوع البري في قفص تربية. تسقط البيوض المخصبة في القاع، حيث يتم جمعها ونقلها إلى طبق بتري. تُحضن الأجنة طوال الليل، ثم توضع في آبار فردية بصفيحة ذات قاع مستدير تحتوي على 96 بئراً.

تتم إضافة الجزيء الصغير BCI للتنشيط المفرط لإشارات FGF، ثم تُحضن الصفيحة لمدة ست ساعات. يتم التقاط صور لكل بئر باستخدام قارئ صفائح بؤري (confocal plate reader) وتحليلها باستخدام خوارزمية مصممة ذاتياً تقوم برصد شدة الفلورة في تراكيب جنينية محددة. مرحباً، أنا هبة قدو من مختبر الدكتور مايكل تشانغ في قسم الميكروبيولوجيا والوراثة الجزيئية بجامعة بيتسبرغ.

مرحباً، أنا أندريا سبوك من معهد اكتشاف الأدوية بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لكم اليوم إجراءات تربية واختيار وترتيب أجنة سمك الزيبرا للمعالجة الكيميائية. سنستخدم في طبق يحتوي على 96 بئراً أجنة معدلة وراثياً تعطي إشارة عن أنشطة عامل نمو الخلايا الليفية، والتي تمت معالجتها بجزيء ينشط هذا المسار بشكل مفرط.

سوف نوضح لكم كيفية استخدام منهجية الفحص عالي المحتوى للحصول على نشاط عامل نمو الأرومة الليفية وتحليله وقياسه كمياً بشكل آلي في أجنة سمك الزيبرا المعدلة وراثياً. سيسلط هذا الإجراء الضوء على تكنولوجيا المنصة المخصصة للاستفادة من سمك الزيبرا المعدل وراثياً وعمليات الفحص الكيميائي عالية الإنتاجية. لذا، فلنبدأ.

قبل يومين من العلاج، حدد أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً الذكور متماثلة الزيجوت وضعها في أحواض تزاوج فردية. أضف فواصل إلى الأحواض، ثم أضف سمكة أنثى من النوع البري إلى كل حوض واترك الأسماك في أقفاص التزاوج طوال الليل عند 28 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة الفاصل. وبعد مرور ساعة واحدة، انقل الأسماك إلى حوض جديد واسكب الأجنة في منخل بلاستيكي.

انقل الأجنة إلى أطباق قطرها 100 مليمتر تحتوي على محلول E3، ثم حضّنها عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة تتراوح بين ست إلى ثماني ساعات. وبعد انتهاء فترة التحضين، افحص الأجنة تحت مجهر ستيريو. وتكون الأجنة المناسبة للتجارب هي التي تمر بمرحلة التغاز.

في هذه المرحلة، قم بإزالة أي أجنة غير مخصبة، والتي ستظل في مرحلة الخلية الواحدة. كما يجب إزالة الأجنة غير القابلة للحياة والتي تبدو معتمة أو مشوهة. بعد ذلك، أضف محلول E three طازجاً واحضنها طوال الليل عند 28 °C.

في اليوم التالي، ضع الأجنة تحت مجهر ستيريو فلوري لفرز الأجنة المعدلة وراثياً بناءً على تشابه المرحلة وتجانس تعبير GFP. تظهر الأجنة في عمر 24 HPF حدوداً مرئية بين الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي مع تعبير كثيف لبروتين GFP، وعيوناً مكتملة التكوين مع شبكيات ظهرية إيجابية لـ GFP. تكون هذه الأجنة نشطة وتتحرك وتتلوى داخل غشائها الكوريوني عند استخدام ماصة بلاستيكية رعوية.

انقل الأجنة التي بلغت 24 HPF واحدة تلو الأخرى إلى آبار فردية في طبق مكون من 96 بئراً. وباستخدام ماصة دقيقة، أزل أي كمية زائدة من محلول E three من الآبار. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 200 µL من محلول E three إلى كل بئر.

بعد ذلك، أضف 2 µL من DMSO إلى جميع الآبار في العمودين 1 و12. ثم أضف 2 µL من BCL المحضر في DMSO وفقاً لما يلي: 1 µM للأعمدة 2 و7، و5 µM للأعمدة 3 و8، و10 µM للأعمدة 4 و9، و20 µM.

أضف تركيز 5 micromolar إلى العمودين الخامس والعاشر، وأخيراً 25 micromolar إلى العمودين السادس والحادي عشر. الآن، قم بتغطية الطبق بورق ألومنيوم وحضنه لمدة ست ساعات عند 28 °C.

أضف 10 µL من الـ trica إلى كل بئر لتخدير أجنة 30 HPF. ثم ضع الطبق في جهاز molecular devices image express ultra وباستخدام برنامج open meta express. اختر إعدادات تتضمن عدسة Forex وأقصى قطر لفتحة الثقب (pinhole).

قم بضبط التركيز التلقائي لليزر للكشف عن قاع الطبق واستخدام إزاحة Z مثالية محددة مسبقاً. وللكشف عن المناطق ذات الأهمية، قم بتعيين منطقة المسح كموقع واحد بمقاس 2000 في 2000 بكسل بدون تجميع (binning). اختر نوع الطبق المناسب وليزر الأرجون بطول موجي 488 nanometer عند أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 488 و 525 nanometers على التوالي.

بعد ذلك، حدد بئراً يحتوي على جنين معالج بمركب حامل (vehicle) وانقر فوق "find sample". سيقوم الجهاز بإجراء مسح للتركيز التلقائي والتقاط صورة واحدة للتأكد من صحة عملية الحصول على الصور. اختر بئراً معالجاً بمركب حامل بشكل عشوائي والتقط صورة.

إذا كانت الصورة واضحة وتظهر تعبيراً عن GFP في الرأس، فضع المؤشر فوق المناطق الأكثر سطوعاً وتحقق من أن كثافة الفلورة تقع ضمن نطاق الكاميرا ذات الـ 16 بت، أي أقل من 65,000 وحدة.

كرر هذه الخطوات مع عينة تحكم أخرى بالمركبة (vehicle control) وبضعة آبار معالجة بالمركب. إذا لزم الأمر، اضبط قدرة الليزر والكسب (gain) بحيث لا يحدث تشبع في المناطق الأكثر سطوعاً في صور التحكم الإيجابي. بعد ذلك، في نافذة الحصول على بيانات اللوحة والتحكم، اختر "acquire plate" لبدء مسح اللوحة.

سيقوم الجهاز تلقائياً بالتقاط صورة واحدة لكل بئر في الصفيحة الدقيقة بالكامل وأرشفتها في قاعدة بيانات SQL server. وبمجرد انتهاء عملية المسح، قم برفع الصور إلى D definition's. Developer عن طريق فتح developer مع تفعيل خيار slinger.

قم بإنشاء مساحة عمل جديدة. ثم من قائمة الملف (file menu)، اختر الاستيراد المخصص (customized import). بعد ذلك، انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور وافتح ملفاً عينة.

اختر مرشح استيراد يتعرف على تنسيق الصور وبنية الملفات التي تنتجها منصة molecular devices image express ultra. ولمعالجة الصور، افتح صورة تحكم وقم بتحميل تكنولوجيا شبكة الإدراك المطلوبة أو خوارزمية CNT أو مجموعة القواعد. تم تصميم الخوارزمية المخصصة المستخدمة هنا لتحديد الجنين والمح وكيس المح تلقائياً، ولقياس سطوع ومساحة هياكل الرأس التي تعبر عن GFP؛ قم بتنفيذ مجموعة القواعد وصولاً إلى مرحلة الكشف عن الرأس والمح.

لضمان التعيين الصحيح لكيس المح وكالرأس، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة الكشف عن المح إذا كان المح كبيراً جداً أو صغيراً جداً. بعد ذلك، قم بتنفيذ مجموعة القواعد وصولاً إلى مرحلة الكشف عن تراكيب الرأس الساطعة. ولضمان التعيين الصحيح للمناطق التي تعبر عن GFP في الرأس، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة الكشف عن تراكيب الرأس كمضاعفات للشدة الدنيا حتى يتطابق الكشف عن تراكيب الرأس الساطعة مع الملاحظة البصرية.

بعد ذلك، قم بتنفيذ مجموعة القواعد بأكملها يدويًا على عدة صور مختارة عشوائيًا تم إنشاؤها من أجنة عولجت بالمركبة الناقلة (vehicle) وصور الضبط الإيجابي من أجنة عولجت بـ PCI. ولتشغيل الخوارزمية على جميع صور الأطباق، حدد الأطباق المراد تحليلها واختر Analyze، ثم انتقل إلى مجموعة القواعد المحسّنة وقم بتحليل جميع الآبار.

باستخدام مجدول المهام المتكامل، سيتم استبعاد الآبار الفارغة أو الصور غير الواضحة تلقائيًا من التحليل أثناء عملية المسح. ويتم عرض خريطة استبقاء يتم تحديثها باستمرار. كما يمكن الوصول إلى كل من البيانات والصور أثناء التشغيل للفحص البصري.

يتم حفظ البيانات الرقمية والصور المعالجة تلقائيًا. وبعد تحليل جميع الصور، يمكن تصدير البيانات إلى برامج خارجية مثل Excel أو GraphPad أو prism. يوضح هذا الشكل صور مسح مؤرشفة لبئر عولج بمركبة وبئر عولج بـ BCI، مع وبدون تحليل CNT.

يتم الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر GFP المطبق في العين، وحدود الدماغ المتوسط والخلفي، والعقد الثلاثمية في الأجنة المعدلة وراثياً. يلاحظ أن كلاً من كثافة GFP ونطاقات التعبير قد توسعت. وفي الأجنة المعالجة بـ BCI هنا، يظهر تأثير يعتمد على الجرعة لـ BCI على تعبير الجين المراسل GFP في الأجنة المعدلة وراثياً.

كان التركيز المطلوب لاستثارة نصف استجابة قصوى أو EC 50 حوالي 12 micromolar. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تربية أجنة سمك الزيبرا المعدلة وراثياً وجمعها وتوزيعها في أطباق ذات 96 بئراً. لقد أضفنا تركيزات متزايدة من PCI في المنشط الخاص بمسار التأشير.

لقد أوضحنا أيضاً كيفية أتمتة تصوير الأجنة المعدلة وراثياً، وقمنا بتحليل الصور باستخدام خوارزمية مصممة خصيصاً تعتمد على تقنية الشبكات الإدراكية. ومن خلال هذا النهج، تمكنا من قياس تأثيرات منشط جزيئي صغير لإشارات عامل نمو الخلايا الليفية قياسياً وبشكل متدرج. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار الأجنة بعناية لتقليل التباين بين العينات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.