باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام التثقيب الكهربائي لإدخال الـ siRNAs إلى الخلايا التي يصعب ترنسفكشنها من أجل دراسة التعبير الجيني. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحديد كمية معلق الخلايا المطلوبة أولاً باستخدام عداد الخلايا الآلي TC 10، ثم يُضاف الـ irna إلى معلق الخلايا ويتم تعريض الخلايا للتثقيب الكهربائي.

باستخدام نظام التثقيب الكهربائي MXL، تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة بعد عملية التثقيب الكهربائي. ثم يُضاف IL four لتحفيز نسخ الجينات في الخلايا التجريبية. وأخيرًا، يتم استخلاص RNA واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) لقياس مستويات التعبير الجيني.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثير جزيئات siRNA محددة على مسارات التعبير الجيني. مرحباً، أنا آدم مكوي، كبير العلماء في قسم التعبير الجيني بمختبرات Bio Rad. سنعرض لكم اليوم إجراءات إدخال جزيئات RNA في خطوط خلوية يصعب ترنسفكشنها عن طريق التثقيب الكهربائي، ومن ثم سننظر في التأثيرات على التعبير الجيني.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتحليل التعبير الجيني لجينات مفردة أو دراسة المسارات الجينية عن طريق تعطيل جين واحد والبحث عن التأثيرات اللاحقة. لنبدأ الآن. أثناء العمل تحت غطاء زراعة الخلايا، قم بإزالة الخلايا من قارورة الزراعة.

الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول هي خلايا معلقة. إذا كنت تستخدم خلايا ملتصقة، فستحتاج إلى استخدام التربسين قبل إزالتها. قم بطرد الخلايا مركزياً لترسيبها.

بعد تدوير الخلايا لترسيبها، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في PBS. ولتحديد عدد الخلايا الحية، خذ عينة من معلق الخلايا وأضف صبغة tripan blue بنسبة واحد إلى واحد لصبغ الخلايا الميتة. إن صبغة tripan blue مطلوبة لتقييم الخلايا الحية والميتة، ولكنها ليست ضرورية لحساب العدد الإجمالي للخلايا.

قم بنقل الخليط بواسطة الماصة فقط إلى فتحة شريحة عدّ تستخدم لمرة واحدة، ثم أدخلها في جهاز عد الخلايا الآلي TC 10. سيقوم جهاز TC 10 أولاً بضبط التركيز التلقائي لضمان دقة العد، ومن ثم سنبدأ في عد الخلايا. ستظهر على الشاشة أعداد الخلايا الحية وإجمالي الخلايا لكل مليلتر في العينة.

اختر عرض الصورة لإظهار الخلايا على شاشة العرض. ثم باستخدام الأسهم للأعلى أو للأسفل، قم بالتكبير أو التصغير حسب الحاجة لحساب كمية معلق الخلايا المطلوبة للتجارب، واختر حاسبة التخفيف.

أدخل قيم التركيز والحجم النهائي المطلوبين لهذه التجربة. سيتم تحضير 16 عينة إجمالية، بما في ذلك عينات مكررة لكل معاملة. وبذلك، ستكون هناك حاجة إلى 3.6 milliliters إجمالاً من معلق بتركيز 5 × 10⁶ cells per milliliter.

سيقوم عداد الخلايا بعد ذلك بتحديد حجم معلق الخلايا المطلوب بناءً على عدد الخلايا الحية والقيم المستهدفة التي تم إدخالها. وفي حال استخدام صبغة TRIAM blue، سيقوم العداد تلقائياً بتعديل الحسابات وفقاً للتخفيف بنسبة واحد إلى واحد المستخدم. والآن، وأثناء العمل تحت غطاء التدفق الصفائحي، قم بنقل الحجم المحسوب من معلق الخلايا إلى أنبوب جديد.

بعد ذلك، قم بتدوير خلائط الخلايا لترسيب الخلايا أثناء عملية الدوران. جهّز أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لعملية التثقيب الكهربائي عن طريق إضافة SIR A إلى كل أنبوب. بالنسبة لهذه التجربة، سيتم تحضير ضوابط irna واحدة، واثنان من stat six siRNAs محددة، وضوابط غير مستأصلة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة PBS وأعد تعليق الخلايا في 3.6 milliliters من منظم gene Pulser للتثقيب الكهربائي، ثم انقل حصصاً بحجم 800 microliter إلى الأنابيب التي تحتوي على IRNA المناسب واخلطها بلطف.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لعملية التثقيب الكهربائي لمعالجة جميع العينات في آن واحد. باستخدام نظام التثقيب الكهربائي MXL، يتم نقل 150 µL من كل معلق خلوي إلى الآبار المناسبة في لوحة تثقيب كهربائي ذات 96 بئرًا. بعد ذلك، توضع اللوحة في غرفة اللوحات بنظام التثقيب الكهربائي MXL ويُغلق الغطاء.

اختر بروتوكول التثقيب الكهربائي المطلوب واضغط على زر النبضة (pulse) لمعالجة الخلايا، وبعد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، أخرج الطبق من الجهاز وانقل الخلايا إلى طبق زراعة أنسجة جديد يحتوي على وسط غذائي مُدفأ مسبقاً. بعد ذلك، انقل 150 µL من الخلايا الضابطة غير المعالجة لكل عينة إلى الطبق الجديد. ثم ضع الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide طوال الليل.

بعد مرور 24 ساعة، استخدم IL four لتحفيز نسخ الجينات في مجموعة واحدة من الخلايا، وأضف الوسط الغذائي فقط إلى المجموعة الثانية. تضاف كمية واحدة من IL four إلى الخلايا. تحضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide بعد إجمالي 48 ساعة من النمو.

قد تظهر فروق كبيرة في كثافة الخلايا إذا كان العلاج التجريبي يؤثر على انقسام الخلايا. لذا، يُنصح باستخدام عداد الخلايا الآلي TC 10 لإعادة عد الخلايا بسرعة بناءً على تعدادات الخلايا. انقل جزءاً واحداً من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لاستخلاص RNA ثم قم بتجميده.

تُستخدم حصة ثانية لتقنية لطخة وسترن أو لتحليلات بروتينية أخرى. سيتم عرض سير عمل RNA فقط اليوم. قم بطرد العينات مركزياً لترسيب الخلايا.

بعد ذلك، قم بإزالة والتخلص من الطور العلوي (SUP) من كل أنبوب. تابع عملية استخلاص الـ RNA باستخدام طقم orum total RNA. وبمجرد استخلاص الـ RNA، ابدأ بالتحليل فوراً، مع الحفاظ على العينات مبردة على الثلج.

للتحقق من جودة وكمية الـ RNA في خطوة واحدة، استخدم محطة الفصل الكهربائي الآلية Experian لعملية المسخ الحراري للعينات وسلم RNA Experian ثم وضعهما على الثلج. أضف مزيجاً مُعداً من الهلام والصبغة إلى بئر التحضير في شريحة RNA، ثم اضبط رمز التحضير في محطة التحضير.

ضع الشريحة في محطة التحضير الآلية واضغط على زر البدء. أخرج الشريحة من محطة التحضير وقم بتحميلها. استخدم جهاز المرج (Vortex) لخلط العينات مع محلول التحميل.

ضع الشريحة في محطة الفصل الكهربائي وابدأ التشغيل. سيعرض برنامج Experian النتائج تلقائياً في شكل مخطط كهربائي (electropherogram)، وجدول نتائج يوضح تركيز RNA والنسبة الريبوسومية، ورقم مؤشر جودة RNA (RQI)، بالإضافة إلى هلام افتراضي يشبه إلى حد كبير هلام RNA التقليدي. وعادةً ما تمتلك عينات RNA الكلية عالية الجودة قيمة RQI تتراوح بين 8 و10.

بعد التحقق من جودة الـ RNA، قم بتحضير تفاعلات الـ CD NA هنا. يُستخدم مزيج IS script ONEstep R-T-P-C-R لدمج تخليق الـ CD NA مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR). في تفاعل واحد، قم بإعداد مزيج رئيسي (master mix) يحتوي على جميع مكونات التفاعل باستثناء قوالب الـ RNA لكل مجموعة من البادئات.

بعد ذلك، وزع الخليط في آبار لوحة PCR. بعد تخفيف الـ RNA إلى تركيز موحد، أضف العينات إلى الآبار المناسبة وبثلاث مكررات. أحكم غلق اللوحة، ثم ضعها في جهاز realtime PCR، واختَر البروتوكول المناسب وابدأ التشغيل؛ وبمجرد اكتمال التشغيل، استخدم تتبعات realtime لتحديد مستويات التعبير.

يقوم البرنامج بحساب التعبير الجيني المعير من البيانات بناءً على التعبير النسبي للجينات التجريبية والمرجعية في الخلايا المعالجة والخلايا الضابطة. يوضح هذا الشكل نظرة عامة على مسار إشارات IL four وارتباط IL four بمستقبله، مما يؤدي إلى ديمرة وتنشيط STAT six، ثم ينتقل STAT six المنشط إلى النواة ويحفز نسخ جيناته المستهدفة.

بالنسبة لجينات مثل CCL 17، فإنه في غياب تحريض IL 4، سيظل نسخ CCL 17 عند مستويات تأسيسية منخفضة بعد إسكات جين STAT 6 بوساطة irna. ومن المفترض أن يؤدي العلاج بـ IL 4 إلى زيادة طفيفة أو عدم حدوث زيادة في تعبير CCL 17. وقد تم قياس تحريض CCL 17 بواسطة IL 4 في ظروف مختلفة باستخدام تقنية الزمن الحقيقي الكمية.

أظهرت عينات PCR التي نُميت بدون IL four مستوى تعبير تأسيسي منخفض. وبغض النظر عن الـ sir، فقد استجابت عينات التحكم A الموضحة باللونين الأخضر والأزرق بشكل طبيعي للمعالجة بـ IL four، مع تحريض لـ CCL 17 بمقدار ثمانية إلى عشرة أضعاف. ومع ذلك، فإن الخلايا التي تم ترانسفكشنها بـ siRNAs التي تستهدف STAT six الموضحة باللونين الأحمر والوردي أظهرت انخفاضاً في تعبير CCL L 17 استجابةً لـ IL four، مما يدعم الفكرة القائلة بأن STAT six يلعب دوراً في التعبير عن CCL 17 المحفز بواسطة IL four.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إدخال الـ siRNAs في خط خلايا معلقة يصعب ترصيدها، وكيفية تتبع التعبير الجيني في تلك الخلايا. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر الحفاظ على أكبر قدر ممكن من الاتساق عبر جميع العينات. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.