باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa
April 14th, 2010
يصف هذا الإجراء سير عمل سريعة وسهلة لإدخال سيرنا إلى الصعب transfect خطوط الخلايا والجينات التي تتبع في الوقت الحقيقي PCR. استخدام عداد الخلية الآلي ، وكذلك لوحة متعددة electroporation ، ومؤتمتة محطة الكهربائي تقديم نتائج سريعة وموثوق بها من دون الحاجة للتعامل مع آلية مكلفة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام التثقيب الكهربائي لإدخال siRNAs في الخلايا التي يصعب نقلها من أجل دراسة التعبير الجيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد كمية تعليق خلية awa المطلوبة أولا باستخدام TC 10. ثم تتم إضافة عداد الخلايا الآلي irna إلى تعليق الخلية ويتم إنشاء الخلايا بالكهرباء.
باستخدام نظام التثقيب الكهربائي MXL ، يتم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة بعد التثقيب الكهربائي. ثم يضاف IL أربعة للحث على نسخ الجينات في الخلايا التجريبية. أخيرا ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لقياس مستويات التعبير الجيني.
في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثير siRNAs محددة على مسارات التعبير الجيني. مرحبا ، أنا آدم مكوي ، كبير العلماء في قسم التعبير الجيني في مختبرات Bio Rad. سنعرض لك اليوم إجراء إدخال الحمض النووي الريبي في خطوط الخلايا التي يصعب نقلها عن طريق التثقيب الكهربائي ثم نلقي نظرة على التأثيرات على التعبير الجيني.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتحليل التعبير الجيني للجينات المفردة أو دراسة المسارات الجينية عن طريق التخلص من جين واحد والبحث عن التأثيرات النهائية. لذلك دعونا نبدأ. من خلال العمل تحت غطاء مزرعة الخلية ، قم بإزالة الخلايا من قارورة المزرعة.
الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول هي خلايا معلقة. إذا كنت تستخدم خلايا ملتصقة ، فستحتاج إلى عيون التربسين قبل إزالتها. الطرد المركزي الخلايا لتكويبها.
بعد أن يتم تدوير الخلايا لأسفل ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في PBS. لتحديد عدد الخلايا الحية ، خذ حصة من تعليق الخلية وأضف بقعة زرقاء ثلاثية بنسبة واحد إلى واحد لتلطيخ الخلايا الميتة. Trian blue مطلوب لتقييم الخلايا الميتة الحية ، ولكن ليس لإجمالي عدد الخلايا.
قم فقط بوضع الأنبوب في الخليط على فتحة شريحة عد يمكن التخلص منها وأدخلها في عداد الخلايا الآلي TC 10. سيقوم TC 10 أولا بالتركيز التلقائي لضمان العدد الأكثر دقة ثم سنبدأ في عد الخلايا. يتم عرض عدد الخلايا الحية والكلية لكل مليلتر في العينة.
حدد عرض الصورة لعرض الخلايا على شاشة العرض. ثم باستخدام الأسهم لأعلى أو لأسفل. قم بالتكبير أو التصغير حسب الحاجة لحساب مقدار تعليق الخلية المطلوب للتجارب، حدد حاسبة التخفيف.
أدخل التركيز المطلوب وقيم الحجم النهائي لهذه التجربة. سيتم إعداد 16 عينة إجمالية ، بما في ذلك التكرارات لكل علاج. لذلك ستكون هناك حاجة إلى ما مجموعه 3.6 ملليلتر من خمسة في 10 من الخلايا الست لكل معلق مليلتر.
سيقوم عداد الخلايا بعد ذلك بالإبلاغ عن حجم تعليق الخلية المطلوب بناء على عدد الخلايا الحية والقيم المستهدفة التي تم إدخالها. إذا تم استخدام TRIAM blue ، ضبط العداد تلقائيا للتخفيف الفردي المستخدم. الآن تحت غطاء محرك السيارة ، قم بنقل الحجم المحسوب لتعليق الخلية إلى أنبوب جديد.
ثم قم بتدوير مخاليط الخلايا لحبيبات الخلايا أثناء دوران الخلايا. قم بإعداد أنابيب fuge دقيقة للتثقيب الكهربائي عن طريق إضافة SIR A إلى كل أنبوب. لهذه التجربة ، سيتم إعداد عناصر التحكم في irna اثنين من الإحصائيات وستة siRNAs محددة وأدوات التحكم غير المقطوعة بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة PBS وإعادة تعليق الخلايا في 3.6 ملليلتر من الجين Pulser electroporation buffer نقل 800 ميكرولتر إلى أنابيب تحتوي على IRNA المناسب وتخلط برفق.
الخلايا جاهزة الآن للتثقيب الكهربائي لأكل جميع العينات في وقت واحد. باستخدام نظام التثقيب الكهربائي MXL ، قم بنقل 150 ميكرولترا من كل معلق خلية إلى الآبار المناسبة للوحة التثقيب الكهربائي 96 بئر. بعد ذلك ، ضع اللوحة في حجرة اللوحة لنظام التثقيب الكهربائي MXL وأغلق الغطاء.
حدد بروتوكول التثقيب الكهربائي المطلوب واضغط على النبض لأكل الخلايا بعد اكتمال التثقيب الكهربائي ، وقم بإزالة اللوحة من الجهاز ونقل الخلايا إلى لوحة زراعة أنسجة جديدة تحتوي على التسخين المسبق إلى المتوسط. بعد ذلك ، انقل 150 ميكرولترا من خلايا التحكم غير المصنفة لكل عينة إلى الطبق الجديد. ثم ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.
بعد 24 ساعة ، استخدم IL four للحث على نسخ الجينات في مجموعة واحدة من الخلايا وإضافة وسيط فقط إلى المجموعة الثانية. يضاف IL واحد أربعة إلى الخلايا. احتضان 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد ما مجموعه 48 ساعة من النمو.
يمكن أن تكون هناك اختلافات كبيرة في كثافة الخلايا إذا كان العلاج التجريبي يؤثر على انقسام الخلايا. لذلك من الجيد استخدام عداد الخلايا الآلي TC 10 لحساب الخلايا بسرعة مرة أخرى بناء على عدد الخلايا. انقل قطعة واحدة من كل بئر إلى أنبوب فوج صغير لاستخراج الحمض النووي الريبي وتجميده.
حصة ثانية للنشاف الغربي أو تحليل البروتين الآخر. اليوم سيتم عرض سير عمل الحمض النووي الريبي فقط. الطرد المركزي للعينات لحبيبات الخلايا.
ثم قم بإزالة وتخلص من SUP natin من كل أنبوب. استمر في استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي الكلي orum. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي ، تابع التحليل على الفور ، مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد.
للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي وكميته في خطوة واحدة ، استخدم حرارة محطة الرحلان الكهربائي الآلي Experian لتشويه طبيعة العينات وسلم الحمض النووي الريبي Experian وضعها على الجليد. أضف خليطا محضرا من الجل وصمة عار إلى الفتلة. حسنا ، على شريحة الحمض النووي الريبي ، قم بتعيين رمز التحضير على محطة التحضير.
ضع الشريحة في محطة التحضير الآلي واضغط على ابدأ. قم بإزالة الشريحة من محطة التحضير وقم بتحميل الشريحة. دوامة الرقاقة لخلط العينات مع عازلة التحميل.
ضع الشريحة في محطة الرحلان الكهربائي وابدأ الجري. سيعرض برنامج Experian النتائج تلقائيا في شكل مخطط كهربية ، وجدول نتائج يعرض نسبة الريبوسومات لتركيز الحمض النووي الريبي ، ورقم مؤشر جودة الحمض النووي الريبي وهلام افتراضي ، والذي يشبه هلام الحمض النووي الريبي التقليدي. عادة ما يكون لعينات الحمض النووي الريبي الإجمالية عالية الجودة RQI من ثمانية إلى 10.
بعد التحقق من جودة الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد تفاعلات CD NA هنا. يتم استخدام مزيج البرنامج النصي IS ONEstep R-T-P-C-R للجمع بين توليف CD NA و PCR في الوقت الفعلي. في تفاعل واحد ، قم بعمل مزيج رئيسي يحتوي على جميع مكونات التفاعل باستثناء قوالب الحمض النووي الريبي لكل مجموعة أولية.
ثم وزعي المزيج في آبار لوحة PCR. بعد تخفيف الحمض النووي الريبي إلى تركيز موحد ، أضف العينات إلى الآبار المناسبة وقم بتكرارها ثلاث مرات. أغلق اللوحة ، وضعها في جهاز PCR في الوقت الفعلي ، ثم حدد البروتوكول المناسب وابدأ التشغيل بمجرد اكتمال التشغيل ، واستخدم التتبعات في الوقت الفعلي لتحديد مستويات التعبير.
يحسب البرنامج التعبير الجيني الطبيعي من البيانات بناء على التعبير النسبي للجينات التجريبية والمرجعية في الخلايا المعالجة والخاضعة للرقابة. يوضح هذا الشكل نظرة عامة على ربط مسار الإشارات الأربعة IL ل IL أربعة بمستقبله. يؤدي إلى يوميات وتنشيط STAT ستة ، ينتقل STAT ستة المنشط إلى النواة وينشط نسخ هدفه.
ستبقى الجينات مثل CCL 17 بدون النسخ الاستتعريفي الرابع ل IL ل CCL 17 عند مستويات تأسيسية منخفضة بعد إسكات الجين STAT الستة بوساطة irna. يجب أن يؤدي العلاج بالوريثة العصبية الأربعة إلى زيادة طفيفة أو معدومة في تعبير CCL 17. تم قياس تحريض CCL 17 بواسطة IL four في ظروف مختلفة من خلال الوقت الفعلي الكمي.
عينات تفاعل البوليميراز المتسلسل المزروعة بدون IL أربعة كان لها مستوى تأسيسي منخفض من التعبير. بغض النظر عن السير ، استجابت A كما هو موضح في عينات التحكم باللونين الأخضر والأزرق بشكل طبيعي للعلاج ب IL four مع تحريض من ثمانية إلى عشرة أضعاف ل CCL 17. ومع ذلك ، فإن الخلايا المنقولة باستخدام siRNAs التي تستهدف STAT ستة الموضحة باللونين الأحمر والوردي قد قللت من تعبير CCL L 17 استجابة ل IL four يدعم فكرة أن STAT six يلعب دورا في التعبير المستحث ل IL الأربعة عن CCL 17.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية وضع siRNAs في خط خلية معلق يصعب نقله وكيفية اتباع التعبير الجيني في تلك الخلايا. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على اتساق الأشياء قدر الإمكان عبر جميع العينات. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
النظرة العامة
تصف هذه الإجراء سير عمل لإدخال siRNA إلى خطوط الخلايا التي يصعب نقلها وتحليل التعبير الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. استخدام الأنظمة الآلية يعزز الكفاءة والدقة في العملية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- التعبير الجيني
- تقنيات الكهربائية
الخلفية
- الكهربائية هي طريقة مستخدمة لإدخال الأحماض النووية إلى الخلايا.
- خطوط الخلايا التي يصعب نقلها تمثل تحديات في دراسات التعبير الجيني.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي هو طريقة موثوقة لتقدير التعبير الجيني.
- يمكن للأنظمة الآلية تبسيط سير العمل وتحسين النتائج.
غرض الدراسة
- لإدخال siRNAs إلى خطوط الخلايا الصعبة.
- لتقييم تأثير siRNAs على مسارات التعبير الجيني.
- لاستخدام التقنيات الآلية من أجل الكفاءة.
الطرق المستخدمة
- تحضير تعليق الخلايا والعد باستخدام عداد الخلايا الآلي.
- الكهربائية للخلايا باستخدام siRNA باستخدام نظام الكهربائية MXL.
- تحريض نسخ الجينات باستخدام IL-4.
- استخراج RNA متبوعاً بالتحليل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- إدخال siRNAs الناجح إلى خطوط الخلايا الصعبة.
- قياس كمي لمستويات التعبير الجيني.
- تبيين تأثيرات siRNAs المحددة على مسارات الجينات.
- عينات RNA عالية الجودة مناسبة للتطبيقات اللاحقة.
الاستنتاجات
- تسهل الإجراء بشكل فعال إدخال siRNAs وتحليل التعبير الجيني.
- تعزز الأنظمة الآلية موثوقية النتائج.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في سياقات بحثية مختلفة تتضمن التعبير الجيني.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This workflow enables efficient siRNA delivery into difficult-to-transfect suspension cells, supporting target validation in gene expression studies. Automated cell counting and electroporation improve reproducibility and throughput in early discovery workflows. The approach facilitates mechanistic de-risking of signaling pathways such as IL-4/STAT6 in oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulators like STAT6 in cytokine signaling pathways.
- Operational Value: Uses automated cell counting to standardize input concentrations for consistent transfection efficiency.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking siRNA knockdown to downstream gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative gene expression readouts via real-time PCR for pathway analysis.
- Operational Value: Integrates automated electrophoresis for rapid RNA quality and quantity assessment.
- Scalability: MXL electroporation system allows simultaneous processing of multiple samples in 96-well format.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses Namalwa cells, a Burkitt lymphoma model, to study IL-4 dependent gene expression relevant to immune oncology.
- Mechanistic Insight: Demonstrates STAT6’s role in CCL17 induction, supporting biomarker-linked pathway validation.
- Preclinical Continuity: RNA quality verification enables reliable downstream applications including protein analysis and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization by providing reliable gene modulation and quantification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via siRNA-mediated knockdown of signaling nodes in IL-4 pathway.
- Screening: Enables reproducible compound or genetic perturbation assessment through standardized cell preparation.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized gene expression data for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant systems using lymphoma cell models.
- Enterprise Reuse: Automated platforms (TC10, MXL, Experion) are reusable across siRNA, CRISPR, and transfection workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in pathway studies through specific genetic perturbation.
- Operational Value: Automation minimizes user variability in cell counting, electroporation, and RNA QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target-pathway relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, electroporation, and nucleic acid handling.
- Depends on access to automated cell counter, electroporation system, and electrophoresis station.
- Necessitates standardization of RNA extraction and QC protocols across teams.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies across adherent and suspension cell types.
- Practical limitation: Electroporation optimization may be needed for primary or sensitive cell lines.
