تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف تجميعات البروتين الكبيرة باستخدام قياس الطيف الكتلي الهيكلي. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الشعيرات الدموية المطلية بالذهب لتأين الرش الكهربائي بتدفق النانو. كخطوة ثانية ، يتم تحضير العينة ومعايرة مطياف الكتلة لقياسات الكتلة العالية.

بعد ذلك ، يتم تحسين الظروف التجريبية من أجل الحفاظ على مجمعات البروتين سليمة في الطور الغازي. ثم يتم الحصول على MS و Tandem Ms.Spectra. أظهرت أطياف MS حالات شحنة تتوافق في الكتلة مع المركب السليم بينما أسفرت تجارب MS الترادفية عن نمط ارتباط المونومرات والمجمعات المجردة.

مرحبا ، أنا نام كيبا من مختبر ميرون في معهد وايتمان للعلوم ، وأنا إسحاق كي ، أنا أيضا من مختبر ميشيلون. نود اليوم أن نعرض لك الإجراء الأساسي لتحليل مجمعات البروتين الكبيرة من خلال تطبيق قياس الطيف الهيكلي ، ونستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتوصيف مجمعات البروتين لتحديد هندسة مخزونك وتكوينه وشبكات التفاعل. لذلك دعونا نبدأ.

يتم إجراء تحليل مجمعات البروتين غير الحالية المرتبطة بتقنية التحصين بالرش الهوائي باستخدام emme plus أو qua capileies. يمكن سحب هذه الشعيرات الدموية C إلى طرف رفيع يبلغ قطره حوالي ميكرون واحد ثم تغليفها بمواد موصلة مثل الذهب. هذه الشعيرات الدموية متاحة تجاريا كما ترون هنا.

ومع ذلك ، فهي أكثر فعالية من حيث التكلفة للاستخدام. يتم تنفيذ الشعيرات الدموية الزجاجية ، والتي يمكن أن تكون باردة ومغلفة بالتبريد الجاهز للاستخدام ، على جهاز تجميع الإبرة هذا والطلاء على جهاز الطلاء هذا لبدء هذا الإجراء ، قم بإرفاق شريطين من وسادة لاصقة على الوجهين في قاع طبق بتري ، مع الحفاظ على المسافة بين الشرائط سنتيمترين.

ضع قضيبا زجاجيا في وسط إحدى الفوط. تثبت الوسادة اللاصقة الشعيرات الدموية في مكانها ويدعم القضيب الزجاجي الشعيرات الدموية المحضرة ويمنع الأطراف من الانكسار للشعيرات الدموية. تستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية سيليكات بوريس بقطر خارجي واحد ملليمتر وقطرها 0.78 ملم.

أدخل شعيرات دموية واحدة في الإبرة ، وقم بتجميع الشعيرات الدموية برفق في مكانها واضبط موضعها بحيث تقع في وسط خيوط التسخين. شد المشابك برفق حتى تثبت الشعيرات الدموية ثابتة في كلا الطرفين. اسحب الشعيرات الدموية باستخدام البرنامج المحدد مسبقا الموضح هنا.

ومع ذلك ، تذكر أن عملية برمجة المجتذب هي عملية التجربة والخطأ. حتى يتم الحصول على شكل طرف مقبول ، فإن كل شعيرات دموية يتم سحبها تؤدي إلى ظهور شعيرتين شعيريين على شكل نهائي. قم بإزالة الشعيرات الدموية المسحوبة من الأداة وافحص الأطراف ، وتخلص من أي شعيرات دموية مشوهة أو مكسورة.

استخدم ملاقط غير حادة لوضع الشعيرات الدموية في طبق بتري. تتكئ قاعدة الشعيرات الدموية المتصلة بالوسادة اللاصقة والجزء العلوي على القضيب الزجاجي مع طرف يشير لأعلى. استمر في سحب الشعيرات الدموية حتى يمتلئ طبق بتري.

حوالي 80 شعيرات دموية تتناسب مع طبق قطره 10 سم. بعد ذلك ، قم بتغطية الشعيرات الدموية بالذهب. أدخل اللوحة في كوتر الرش الذهبي.

تأكد من اختيار مصدر الغاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتنشيط دورة طلاء محددة مسبقا. يتكرر الطلاء ثلاث إلى ست مرات حتى تصبح الشعيرات الدموية ذهبية بشكل متساو. بمجرد أن تصبح الشعيرات الدموية جاهزة ، تابع معايرة مطياف الكتلة.

يتم إجراء معظم التجارب التي أجريت على مجمعات MultiPro بواسطة الرش الكهربائي الرباعي لمطياف كتلة الطيران مثل هذا. Inupt من المياه ، والتي يتم تعديلها للكتل العالية. قبل تحميل عينة البروتين ، قم بمعايرة مطياف الكتلة باستخدام يوديد السيزيوم.

أولا ، قم بإعداد محلول 100 ملليغرام لكل مليلتر من السيزيوم في الماء النقي ، ويستخدم السيزيوم لمعايرة الكتلة العالية. نظرا لأن مجموعات الملح المشحونة منفردة تمتد على نطاق واسع من 393 صاري إلى نسبة شحن إلى أكثر من 10،000. باستخدام ملاقط غير حادة ، خذ شعيرات دموية مطلية من طبق بتري وقم بتحميل ميكرولترين من محلول السيزيوم في الشعيرات الدموية.

باستخدام طرف محمل بجل einor. حرك المحلول باتجاه طرف الشعيرات الدموية، إما يدويا أو استخدم محول الدوران. أدخل الشعيرات الدموية في حامل الشعيرات الدموية واضبط الشعيرات الدموية بحيث يكون الطرف على بعد 10 ملم تقريبا من حافة الحامل.

ضع الشعيرات الدموية تحت مجهر ضوئي واستخدم ملاقط حادة من النوع AA لقص الحافة. من المهم التحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل الشعيرات الدموية يمكن أن تمنع التدفق وأن الشعيرات الدموية غير مسدودة. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من عدم تجريد الطلاء الذهبي من الشعيرات الدموية.

إذا كان الأمر كذلك ، فاستبدل الشعيرات الدموية أو قم بقص الطرف وإزالة الجزء غير المطلي. بعد ذلك ، قم بتوصيل حامل الشعيرات الدموية بواجهة ESI لتدفق النانو. قم بتدوير المرحلة XY و Z للخلف لتجنب إتلاف الشعيرات الدموية ودفع المسرح إلى موضعها المنشط.

يجب وضع الشعيرات الدموية على مسافة واحدة إلى 10 ملم من الفتحة المخروطية. قم بتطبيق الجهد الشعري وضغط تدفق النانو المنخفض حتى يبدأ الرش. ثم حاول تقليل ضغط تدفق النانو إلى الحد الأدنى من القيمة.

قم بتحسين شدة الإشارة عن طريق ضبط موقع مرحلة XYZ ، والجهد الشعري ، وضغط تدفق النانو ، وتدفق غاز الذوبان. للكشف عن نطاق واسع من سلسلة ذروة الموسم ، يجب تحسين الفولتية المتسارعة. المعلمات المستخدمة هنا هي الشعيرات الدموية من 1.3 إلى 1.7 كيلو فولت مخروط عينة من 80 إلى 150 فولت ، ومخروط استخراج ، من واحد إلى ثلاثة فولت لتحسين نقل الأيونات عالية الكتلة ، والتي تتطلب ظروف تحلية لطيفة.

يتم رفع ضغط الظهر إلى خمسة إلى ستة مللي بار في مرحلة الفراغ الأولية بين المصدر والمحلل. لرفع ضغط الدعم ، قلل بعناية من توصيل خط تفريغ المصدر إلى مضخة التمرير عن طريق إغلاق صمام العزل جزئيا أثناء مراقبة التأثير على شدة الإشارة. عند اكتمال إعداد مطياف الكتلة ، اجمع حوالي 30 مسحا ضوئيا بمسح ضوئي واحد في الثانية بنطاق نسبة شحن رئيسية يتراوح بين 1000 إلى 15،000 بعد الاستحواذ ، قم بمعايرة وقت الرحلة باستخدام جدول المعايرة المناسب.

الآن بعد اكتمال المعايرة ، يمكن تحميل عينة البروتين. يتم تحضير العينة قبل معايرة مطياف الكتلة ، ويلزم وجود تركيزات ميكرومولار منخفضة. إذا لزم الأمر ، قم بتركيز العينة باستخدام أجهزة الترشيح الفائق بالطرد المركزي.

تحقق من عدم امتصاص مركب البروتين في غشاء الجهاز قبل الاستخدام. من خلال التحقق من الحجم وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، يمكن استخدام المحاليل المتطايرة فقط ل NESI ، مما يجعل تبادل المخزن المؤقت ضروريا. يمكن استخدام عمود ترشيح هلام الطرد المركزي الصغير لإزالة جميع آثار الأملاح أو الجزيئات العازلة أو أي مقاربات أخرى غير متطايرة.

بدلا من ذلك، العينة. محلول أسيتات الأمونيوم المائي. تحدد هذه الخطوة الحاسمة جودة الأطياف.

كرر التبادل المؤقت حتى ثلاث مرات بأقل قدر من التخفيف ، أقل من 1.3 عامل لكل جهاز حتى يتم تحقيق الحد الأقصى للتبادل. إذا كان كل من التركيز والتبادل المؤقت مطلوبين ، فيمكن القيام بذلك معا باستخدام الترشيح الفائق بالطرد المركزي كما هو موضح للتو في بداية هذا القسم. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة كما هو موضح لمعايرة يوديد السيزيوم وابدأ الرش.

ابدأ بالتحسين الأولي للرش حتى يتم اكتشاف الإشارة. استخدم المعادلة لمتوسط حالة الشحنة الموضحة حيث M هي كتلة المركب. ومع ذلك ، في دالتون ، يعتمد الموضع الدقيق لحالات الشحنة على البروتين.

لمنع التفكك المعقد ، لا تسخن مصدر الحديد. إما أن تغلق السخان أو تحافظ على درجة الحرارة أقل من 40 درجة مئوية. قم بتغيير موضع الشعيرات الدموية ومخروط العينة والجهد المستخرج.

لتحقيق أقصى قدر من نقل الحديد ، فإن نقطة البداية المحتملة هي الجهد المخروطي ، ومخروط الاستخراج 100 فولت ، وفولت واحد والجهد الشعري 1.5 كيلو فولت. تحقق من التغيير الناتج في الأطياف. قم بتحسين هذه المعلمات مع ضغط تدفق النانو لتحسين التأليه وتجريد المياه المتبقية ومكونات العازلة.

زيادة جهد التحيز في ضغط الغاز في خلية الاصطدام. تتراوح الفولتية التحيزية النموذجية من 10 إلى 100 فولت مع تدفق غاز المصيدة من واحد إلى 10 ملليلتر في الدقيقة. قم بذلك بعناية لمنع ارتباط المجمع وضبط المصيدة ونقل طاقات الاصطدام.

غالبا ما تكون الفولتية العالية ، عادة في حدود 10 إلى 30 فولت مطلوبة لنقل أيونات عالية الكتلة. في هذه المرحلة ، من المهم تجنب تفكك المجمع الناجم عن الاصطدام كما هو موضح هنا. بعد الوصول إلى إشارة مستقرة ، أوصت بتقليل ضغط تدفق النانو والجهد الشعري إلى الحد الأدنى من القيم مع الحفاظ على رذاذ مستقر.

بعد جمع العديد من عمليات المسح ، تابع تحديد مكونات المركب عن طريق قياس الطيف الكتلي الترادفي. بمجرد الحصول على إشارة مثالية ومستقرة لمركب البروتين ، حدد أيون سلائف لتعيين مركز الكتلة في عرض العزل. بشكل عام ، تستخدم دقة الكتلة المنخفضة البالغة 12 ودقة الكتلة العالية التي تتراوح بين 13 و 15 نطاقا واسعا من الكتلة للكشف عن منتجات التفكك ذات الشحنة المنخفضة عالية الكتلة ثم تقليلها إلى القيم المرغوبة لأداء مللي ثانية.

MS يفصل السلائف الحديد عن طريق زيادة طاقة الاصطدام اختصار CE والضغط على خلية الاصطدام تزيد إما من المصيدة أو نقل CE تدريجيا في خطوات من 10 إلى 20 فولت ورفع ضغط غاز الاصطدام إلى صفر إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة. راقب التغييرات في الأطياف حتى يتم الوصول إلى ظروف التنشيط المثلى. قد تؤدي طاقة التنشيط العالية إلى تفكك وحدة فرعية واحدة أو أكثر من المركب السليم وتوضيح تقارب التفاعل بين الوحدات الفرعية المختلفة.

حدد أكثر من شحنة واحدة لتحليل MS. في حالة المكونات المتداخلة ، يساعد الحصول على مجموعة من أطياف MS الترادفية في حل سلسلة الشحنات لمجموعات سكانية مختلفة. علاوة على ذلك ، تنفصل حالات الشحن الأعلى بسهولة أكبر مقارنة بحالات الشحن المنخفض التي تراكب MS و MS.

أطياف السيدة للتحقق من عزل أيون السلائف المختار. بالإضافة إلى توصيف المركب السليم بواسطة MS و MS. يولد MS مجمعات فرعية ومحلولا أصغر في ظل ظروف تغيير الطبيعة المعتدلة ويميزها أيضا.

يشكل تحليل MS و MS للمجمعات الفرعية الأساس لتحديد بنية الوحدة الفرعية للمركب للتعطيل الجزئي لتفاعلات الوحدة الفرعية للوحدة الفرعية ، أو إضافة مذيبات عضوية تدريجيا تصل إلى تركيز 50٪ أو تغيير درجة الحموضة للمحلول عن طريق إضافة الأمونيا أو حمض الفورميك حتى تركيز 4٪ ، وأخيرا ، لتحديد كتل الوحدات الفرعية الفردية التي يتكون منها المركب ، من المهم الحصول على الطيف في ظل ظروف تغيير الطبيعة. يمكن تنفيذ ذلك باستخدام طرف مضغوط C أربعة بنسبة نتريل أسيتو مائي من 25 إلى 75 مع حمض الفورميك 1٪ كمذيب إيلوسيان مع جميع البيانات التي تم جمعها العملية وتحليل النتائج كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب المصاحب. قبل تحميل عينة مركب البروتين ، تمت معايرة مطياف الكتلة باستخدام يوديد السيزيوم.

تمتد سلسلة القمم المتباعدة بشكل متساو المميزة باللون الأحمر على نطاق واسع من نسبة الشحن الرئيسية البالغة 393 إلى أكثر من 10،000. يتم تعيينهم لشحن مجموعات الملح منفردة من التركيب العام للسيزيوم بالإضافة إلى المركب. تحدث الإشارات الإضافية بين القمم الرئيسية المميزة باللون الأسود بسبب أنواع الشحنة المزدوجة والثلاثية من سلسلة السيزيوم الثاني زائد المركب والسيزيوم ثلاثة زائد المركب.

زيادة الضغط في مرحلة الفراغ الأولية أمرا ضروريا للكشف عن المجموعات عالية الكتلة. يظهر تأثير الضغط على قمم الكتلة العالية هنا مع قراءة الضغط مرة أخرى 1.2 و 5.3 ملليبار. يظهر الطيف الكتلي للضغط العالي موسعا هنا.

فيما يلي مثال على قياس الطيف الكتلي لمركب متغير الليكتين مما أدى إلى توزيع حالة الشحنة بين 3000 و 5 ، 000 نسبة شحنة رئيسية. ومع ذلك ، بسبب التجفيف الكافي للأيونات ، تكون القمم واسعة. تؤدي زيادة جهد التحيز من أربعة فولت إلى 15 فولت ، مما يؤدي إلى زيادة ظروف التسارع ، إلى تجريد الماء المتبقي والمكونات العازلة مما ينتج عنه طيف عالي الحل ، وتتوافق الكتلة المقاسة مع مركب خماسي.

ثم تم اختيار حالة الشحن زائد 15 لتحليل التصلب العصبي المتعدد الترادفي. تتسبب الزيادة في طاقة الاصطدام في إطلاق مونومر عالي الشحن يتمركز عند نسبة شحنة رئيسية تبلغ 1 ، 664 ومركب رباعي جرد في حدود نسبة شحن كتلة من 5 ، 000 إلى 8 ، 000. كما تم فحص مركب متغير الليكتين في ظل ظروف تغيير الطبيعة مما أدى إلى ارتباط معقد.

بهذه الطريقة ، يمكن تحديد الكتلة الدقيقة للوحدات الفرعية الفردية التي يتكون منها المجمع. لقد أوضحنا لك للتو كيفية الحصول على MS و Ms Spectra الترادفي للأيونات عالية الكتلة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم إعداد عينتك بشكل صحيح واستخدام المخازن المؤقتة فقط المتوافقة مع قياس الطيف الكتلي.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.