في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

تكتسي عملية فك رموز شبكة التفاعلات الجزيئية في الخلايا الحية أهمية خاصة لفهم الآليات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي ووظائف الخلية. وتعد الأعداد المتزايدة من المنهجيات التي توفر معلومات نوعية وكمية هي القوة الدافعة في طريقنا نحو الحصول على صور شاملة لوظائف الخلية. وتسمح اختبارات Co ip أو TAP tag أو الترابط المتقاطع الضوئي بتنقية الجزيئات مسبقاً في المختبر in vitro.

بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم عدة مناهج لتحليل التفاعلات البروتينية في الخلية الحية. وتشمل هذه المناهج فحصين هجينين أو مقايسات تكامل للبروتينات الفلورية. علاوة على ذلك، تم اعتماد بعض المناهج الطيفية مثل fret أو FCS وأيضاً طرق غير طيفية لمعالجة هذه المسألة.

لقد تم تطوير التقنيات المذكورة سابقاً لتسجيل مجموعات كبيرة من الخلايا، إلا أنها تعاني من كونها غير مباشرة إلى حد ما، وبالتالي فهي ليست كمية بما يكفي. في المقابل، تم تقديم عدد قليل من المنهجيات الكمية المتطورة. ومع ذلك، فإن توسيع نطاق الإنتاجية العالية يجعل من الصعب الجمع بين قدرات الإنتاجية العالية وإمكانية استخلاص معلومات كمية.

لقد طورنا مؤخراً مفهوماً جديداً لتحديد التفاعلات بين البروتينات والبروتينات. تقنية التنميط الدقيق هنا هي رسم توضيحي لشبكات SA ذات التنميط الدقيق لـ BSA Sci five المطبوعة على شرائح زجاجية مغطاة ومؤهلة وظيفياً، حيث يتم ملء الفراغات البينية بالستربتافيدين، تليها الليجاندات المبيوتنة. وفي معظم الحالات، تُستخدم أجسام مضادة ضد الغشاء.

بروتين الطعم في الخلايا النامية على رقائق الميكروبيوم هذه. سيتم ترتيب الطعم في الغشاء البلازمي وفقاً للنمط المجهري للأجسام المضادة. يتم استقصاء التفاعلات مع بروتين فريسة ثانٍ مُعلم فلورياً عن طريق قياس درجة التنميط المشترك باستخدام قالب PDMS رئيسي من السيليكون يحتوي على مصفوفة من المربعات ذات حجم وعمق محددين.

يتم إنتاج الأختام ذات الثلاثة ميكرومتر من هلام ثم يتم قصها. تُشطف الأختام بـ 100% ethanol ومياه مقطرة مرتين، وتُجفف باستخدام النيتروجين مسبقاً. ثم تُحضن مع 0.67 mg/mL من sci-fi.

محلول BSA المسمى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء التحضين، ويتم تنظيف شرائح غطاء الزجاج المعدلة بالإيبوكسي بنفس الطريقة. وبنفس الطريقة بعد التحبير، تُغسل الأختام باستخدام PBS والماء. لنقل BSA sci five.

يتم تجفيف الختم باستخدام النيتروجين، ثم يُوضع مباشرة بعد ذلك تحت غطاء زجاجي (cover slip) بوزنه الذاتي لمدة 30 Minutes. يتم تحديد موقع حقل النمط الدقيق على الجانب الخلفي من الغطاء الزجاجي. وعند إزالة الأختام، يتم إغلاق الأغطية الزجاجية باستخدام أقنعة سيليكون لاصقة.

تُملأ الغرف بمحلول Streptavidin بتركيز 50 microgram per milliliter ويُحضن لمدة ساعة واحدة، ثم تُشطف بعد ذلك بـ 1 milliliter من محلول PBS. لاحقاً، تُحضن أنماط الستريبتيفيدين مع جسم مضاد مبيوتني (biotinylated antibody) بتركيز 10 micrograms per milliliter لمدة ساعة واحدة، وبعد الغسل بمحلول PBS، تُوضع الخلايا في الغرفة. وعندما تلتصق الخلايا بالسطح، تصبح العينة جاهزة للقياسات.

المتطلب الوحيد لعملية القراءة هو مجهر فلوري قادر على إضاءة العينة في وضع الانعكاس الداخلي الكلي. تتوفر هذه الأنظمة تجارياً من موردين مختلفين، وقد أصبح التعامل معها سهلاً للمستخدم خلال السنوات الماضية. وقد تم إعداد نظام الكشف الخاص بنا على مجهر فلوري علوي (epi fluorescence microscope).

تُستخدم ليزرات أيونات الأرجون والكريبتون للإثارة الفلورية الانتقائية للفلوروفورات المستخدمة، حيث يتم إضاءة العينات في تكوين انعكاس داخلي كلي قائم على الشيئية باستخدام شيئية غمر زيتية ذات فتحة عددية (NA) عالية وتكبير 100 ضعف. وبعد الترشيح المناسب باستخدام مجموعات مرشحات قياسية، يتم تصوير الفلورة على كاميرا CCD ذات إضاءة خلفية. وتتم عملية القراءة في وضع التأخير الزمني والتكامل، مما يسمح بمسح مساحات كبيرة من العينة. ولهذا الغرض، يتم تحريك العينات باستخدام منصة XY آلية متزامنة مع إزاحة خط الكاميرا.

يتم تصوير شعاع الليزر المنعكس على صمام ثنائي ضوئي مكون من جزأين، وتُستخدم الإشارة التفاضلية للتحكم في محرك بيزو (Z pizo) لإعادة التركيز السريع. القارئ مجهز بنظام تثبيت بؤري آلي يعمل أثناء عملية المسح، حيث يتم إجراء مسح أول عند 488 nanometer للإثارة الانتقائية لبروتين GFP، ومسح ثانٍ عند 647 nanometer للإثارة الانتقائية لـ PS Five. ولتحليل البيانات، نستخدم برنامجاً لحساب التباين مكتوباً بلغة MATLAB بناءً على شدة الفلورة داخل منطقة الأجسام المضادة الملتقطة وخارجها.

يتم تحليل مستوى التباين وبالتالي درجة التفاعل البروتيني من أجل التحليل السريع لعدد كبير من الخلايا. كما يمكن استخدام برمجيات مؤتمتة متاحة تجارياً؛ فعلى سبيل المثال، تم اختبار برنامج التصوير scan R المقدم من شركة Olympus بنجاح لتقييم التباين في تجارب التنميط الدقيق.

نحلل هنا التفاعل المعروف بين بروتيني CD4 وLCK في إشارات الخلايا التائية المبكرة كما هو موضح هنا. يعيد LCK الفلوري توزيع نفسه بوضوح على المناطق المغطاة بالأجسام المضادة لـ CD4. ويؤدي تعطيل بنية مشبك الزنك، وهي موقع التفاعل الرئيسي لهذين البروتينين، عن طريق إضافة مخلب الزنك لاحقاً إلى تقليل تباين الأنماط الدقيقة لـ LCK.

باختصار، تتمثل المزايا الرئيسية لتقنية التنميط الدقيق فيما يلي: التكميم للتفاعلات البروتينية المحلية ذات الدقة المكانية. علاوة على ذلك، الكشف عن التفاعلات الضعيفة حتى في الغشاء البلازمي للخلايا الحية، والكشف عن تفاعلات الطعم والفريسة المعدلة، وتحليل حالة الراحة، وقابلية تطبيق هذا النهج للإنتاجية العالية.