ذبابة الفاكهة القياس الكمي للوصلة العصبية العضلية (NMJ): طريقة لتقييم مورفولوجيا الوصلة المشبكية ووظيفتها

- أولا ، يرقات ذبابة الفاكهة المناعية مع علامات تسلط الضوء على جوانب مختلفة من NMJs أو الوصلات العصبية العضلية. هذه هي المنطقة التي تتصل فيها نهاية محور عصبي عصبي حركي بالعضلة ، ويستخدم مورفولوجيتها كقراءة للوظيفة المشبكي.

ينتهي المحور العصبي في عدة فروع تشكل انتفاخات تسمى العروات. يتم إطلاق الناقلات العصبية من العروات وتسبب تقلص العضلات. تسمى مناطق إطلاق الناقل العصبي المناطق النشطة. هنا علامة واحدة خاصة ببروتين متشابك يحدد NMJ ، والعلامة الأخرى خاصة بالبروتين الموجود في المناطق النشطة.

بعد ذلك ، احصل على صور NMJ باستخدام الفحص المجهري وقم بتقييم مورفولوجيتها كميا باستخدام برنامج تحليل الصور شبه الآلي. قم بتطبيق سلسلة محددة مسبقا من أوامر البرامج على الصور. تحتوي ملفات الإخراج على صور NMJ التي تم تحليلها ونتائج الصرف. تشمل الميزات التي يمكن قياسها عدد ومساحة سطح العروات ، وطول NMJ ورقم الفرع ، وعدد مقصورات NMJ غير المتصلة ، وعدد المناطق النشطة.

في المثال التالي ، سنقوم بتحليل مورفولوجيا ذبابة الفاكهة NMJs الملطخة ب DLG1 ، وهي علامة ما بعد المشبكي ، و BRP ، وهي علامة منطقة نشطة.

- بالنسبة لهذا البروتوكول، قم بإنشاء مجموعات صور من NMJs وحفظها كملفات TIFF فردية حيث تعرض القناة 1 تلطيخ DLG1 أو علامة مماثلة وتعرض القناة 2 تلطيخ BRP. للبدء ، قم بإنشاء إسقاطات Z و hyperstacks لملفات صور NMJ. افتح خيارات المكون الإضافي وحدد ذبابة الفاكهة NMJ morphometrics.

الآن ، حدد سلسلة الملفات الفريدة التي عينها المجهر لسلسلة الصور عند تخزينها ك TIFF. سيكون هذا في نهاية اسم الصورة. انسخ والصق السلسلة المعطاة إلى أدنى مستوى ورقم قناة في نافذة إعداد سلسلة الملف الفريدة. ثم حدد الماكرو الفرعي "تحويل إلى مكدس" واختر الدليل أو المجلد الذي توجد به الصور.

لكل ملف صورة، يتم إنشاء ملفين جديدين باستخدام مكدس الأسماء الافتراضي والمكدس المسطح، متبوعا باسم الصورة الأصلي. يمكن بعد ذلك حذف الملفات الأصلية لتوفير مساحة التخزين. بعد ذلك ، من ذبابة الفاكهة NMJ واجهة morphometrics ، حدد الماكرو الفرعي المحدد لعائد الاستثمار واختر دليل ملف الصورة.

عند فتح الإسقاط الأول ، حدد أداة التحديدات اليدوية ، ثم استخدم الماوس لتحديد منطقة تحتوي على محطة NMJ كاملة ذات أهمية. بمجرد تحديده، انقر فوق موافق في نافذة المحطة الطرفية المحددة. استمر في القيام بذلك حتى يتم تحديد أطراف NMJ في جميع التوقعات. يقوم الماكرو بتقدم العملية تلقائيا. لكل ملف صورة ، يتم إنشاء ملف جديد واحد بالأسماء الافتراضية ROI متبوعا باسم الصورة الأصلي.

لتحديد ميزات NMJ ، انتقل أولا إلى ذبابة الفاكهة NMJ واجهة morphometrics وقم بتعيين المقياس. على سبيل المثال، إذا كان بكسل واحد من الصورة يتوافق مع 0.72 ميكرون، فقم بتعيين وحدات بكسل المقياس إلى 1 ومسافة المقياس إلى 0.072. ثم حدد تحليل الماكرو الفرعي ، وإذا كانت هناك صورتان للقناة ، فقم أيضا بالتبديل إلى الانتظار. اضغط على موافق وعندما يطلب منك ذلك، حدد دليل ملف الصورة. يمكن أن يكون وقت المعالجة عدة دقائق لكل مشبك.

بعد التحليل ، يتم تخزين ملفات الصور الجديدة لكل مشبك تم تحليله في المجلد الأبوي ، وتكون القياسات الكمية في ملف results.txt. افحص جميع الصور واستبعد الصور التي تحتوي على أخطاء في التجزئة.

على سبيل المثال، قد لا يتم تضمين أجزاء من الطرف المشبكي في المخطط الأصفر. قد يتم تضمين أجزاء من الخلفية في الطرف المشبكي. قد يمتد خط الهيكل العظمي الأزرق إلى ما وراء الطرف المشبكي. قد يكون هناك عدد كبير جدا من المناطق النشطة، أو قد تظل بعض المناطق النشطة غير مكتشفة.