الإصابة العصبية الناجمة عن الليزر ثنائي الفوتون: طريقة لمراقبة تنكس المحور العصبي وتجديده في يرقات ذبابة الفاكهة

- ابدأ بتركيب يرقة نظيفة ومخدرة تحت غطاء زجاجي مع رفع رأسها. بعد ذلك ، قم بفضح منطقة الاهتمام عن طريق دفع زلة الغطاء برفق لدحرجة اليرقة وضبط موضعها. استخدم التصوير متحد البؤر لتحديد موقع الخلايا العصبية لليرقة. حدد محورا عصبيا معينا على إحدى الخلايا العصبية المستهدفة كموقع للإصابة.

ثم قم بتعريض المحور العصبي المستهدف لليزر ثنائي الفوتون بقوة أعلى من المستخدمة في التصوير لإحداث الضرر. يتم استخدام ليزر ثنائي الفوتون نظرا لقدرته على اختراق الضرر داخل الأنسجة الحية وتوطينه بدقة مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة.

أوقف التعرض لليزر على الفور عند حدوث تلف في الخلايا العصبية المستهدفة ، مما يؤدي إلى بضع المحور العصبي أو قطع المحور العصبي. أخيرا ، قم بتصوير الخلايا العصبية المصابة لعرض تنكسها وتجديدها اللاحق في النقاط الزمنية المطلوبة.

في مثال البروتوكول ، سنقوم بتركيب يرقة للفحص المجهري ، وإحداث تلف للخلايا العصبية الحسية لليرقات ، وتتبع التجديد العصبي.

- ابدأ بتخدير اليرقات. في غطاء الدخان ، ضع طبقا زجاجيا مقاس 60 ملم في طبق بتري بلاستيكي يبلغ طوله 15 سم. ثم قم بطي قطعة من المناديل الورقية وضعها في الطبق الزجاجي. ضع صفيحة أجار العنب على المنديل بعد إضافة ثنائي إيثيل الأثير.

بعد ذلك ، على شريحة زجاجية ، ضع قطرة واحدة من زيت الهالوكربون 27 في المنتصف ، وضع بقعة من الشحوم المفرغة على كل زاوية من الزوايا الأربع. ثم استخدم الملقط لنقل يرقة واحدة إلى صفيحة أجار وتغطية الطبق الزجاجي لتخدير اليرقة. بمجرد أن تتوقف الحمم البركانية عن الحركة ، انقلها بعناية إلى زيت الهالوكربون مع وضع رأسها في وضع رأسها. ثم ضع غطاء على الشريحة واضغط عليه برفق حتى تلامس اليرقة.

بعد ذلك ، استخدم قوة لطيفة لتحريك زلة الغطاء لدحرجة الخلايا المراد استئصالها إلى حيث سيضربها ليزر الفوتون الثنائي بسهولة. سيختلف الموقع اعتمادا على الخلايا العصبية المستهدفة. الآن قم بتأمين التجميع على مرحلة المجهر ثنائي الفوتون والتركيز على الخلايا ذات الأهمية باستخدام هدف غمر الزيت 40x.

في البرنامج ، قم بالتبديل إلى وضع المسح وقم بتحميل البروتوكول المحفوظ. تأكد من فتح الثقب بالكامل. بعد ذلك ، في الوضع المباشر ، احصل على صورة جيدة لمنطقة الاهتمام.

بعد ذلك ، أوقف الفحص المباشر حتى يصبح زر الاقتصاص متاحا. باستخدام وظيفة الاقتصاص ، اضبط نافذة المسح لتركيز المنطقة المستهدفة على موقع الإصابة المحتمل فقط. ثم افتح نافذة تصوير جديدة. الآن تقليل سرعة المسح وزيادة شدة الليزر. ثم قم بتبديل الزر المستمر لبدء الفحص وإيقافه. راقب بعناية. بمجرد حدوث زيادة كبيرة في التألق ، قم بإنهاء الفحص.

بعد ذلك ، ارجع إلى نافذة التصوير الأصلية وحدد الوضع المباشر ، وابحث عن المنطقة التي تم استهدافها للتو عن طريق ضبط التركيز.

- من المؤشرات الجيدة على الإصابة الناجحة ظهور حفرة صغيرة أو هيكل يشبه الحلقة أو حطام موضعي في موقع الإصابة. إذا كانت قوة الليزر عالية جدا ، فستكون هناك منطقة كبيرة متضررة مرئية ، والتي يمكن أن تكون قاتلة.

- الآن قم بإزالة زلة الغطاء بعناية ، وانقل اليرقة المصابة إلى طبق جديد مع معجون الخميرة. ضع الطبق في طبق 60 ملم مع منديل مبلل بحمض البروبيونيك. ثم أعد اللوحة إلى درجة حرارة الاستزراع.

للتصوير اللاحق لليرقة ، استفد من الإعداد متحد البؤر المحفوظ واجمع صور المكدس z بهدف 25x. تأكد من تضمين نقطة التطبيع حتى يمكن تحديد التجديد كميا.