فحص التعديلات الجينومية: طريقة لتحديد الطفرات التي تم إنشاؤها بواسطة كريسبر في ذبابة الفاكهة

- عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى G0 بالغين ، اعبر جميع الذباب الفردي إلى مخزونات موازن مناسبة لتوسيع الخطوط المحررة المحتملة ل F1 CRISPR وتكون قادرا على تتبع وراثة التعديل الجيني. بعد ذلك ، قم بتهجين الذكور الفردية F1 المختارين عشوائيا إلى إناث موازن مناسبة ليتمكنوا من استعادة النسل إذا كان ذكر F1 إيجابيا للطفرة. بمجرد أن يأخذ الصليب ، انقل ذكر F1 إلى أنبوب للفحص.

لاستخراج الحمض النووي الجيني ، اسحق الذبابة بطرف ماصة يحتوي على مخزن مؤقت للاستخراج. بمجرد تكسير الأنسجة ، أخرج السائل. يحتوي المخزن المؤقت للاستخراج على بروتيناز K ، وهو إنزيم يهضم البروتينات في العينة ويتم تعطيله بالحرارة العالية.

الآن بعد أن أصبح الحمض النووي متاحا ، انتقل إلى فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). على سبيل المثال، استخدم البادئات المصممة لتضخيم منطقة تتضمن التسلسل الجديد. فقط في وجود التعديل ، سيتم تضخيم الارتباط التمهيدي الثاني ومنتج PCR. في المثال ، سنرى الذباب يتم تربيته وفحصه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال تسلسل التنشيط الذي يحل محل الإكسون الأول للجين عديم الفروع.

- عندما تتطور أجنة nos-Cas9 التي تم حقنها مسبقا بكل من بلازميد تعبير الحمض النووي الريبي الإرشادي والمتبرع البديل إلى بالغين ، يعبر G0 يطير بشكل فردي إلى الذباب الموازن من خط مناسب للأليل المستهدف. قم بتخدير نسل F1 من كل صليب G0 على وسادة ثاني أكسيد الكربون واختر بشكل عشوائي من 10 إلى 20 ذكرا تحت مجهر ستيريو. اعبر كل ذكر تم اختياره بشكل فردي إلى أنثى موازن من خط مناسب للأليل المستهدف.

عندما تفقس يرقات F2 ، اختر الأب F1 من كل صليب. استخرج الحمض النووي الجيني عن طريق سحق كل ذبابة لمدة 10 إلى 15 ثانية بطرف ماصة يحتوي على 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للسحق دون الاستغناء عن المخزن المؤقت. ثم قم بتوزيع المخزن المؤقت المتبقي في الأنبوب واخلطه جيدا.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب في كتلة حرارية 95 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة لتعطيل البروتيناز K. بعد الدوران لمدة 5 دقائق عند 10,000 مرة جم ، قم بتخزين المستحضر على حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.

قم بإجراء شاشات ثلاثية الخطوات تعتمد على PCR باستخدام الاشعال للأمام 1 والخلف 1 للكشف عن وجود الإدخال أو الاستبدال. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات أمامية 2 وخلفية 2 للتحقق من الإدخال أو الاستبدال من ثلاث مناطق رئيسية. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال M13F والعكس 3 للتحقق من HDR النهائي.

- احتفظ بخطوط الطيران مع HDR المؤكد وقم بإنشاء مخزونات توازن من جيل F2. يطير الميزان مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى.