فحص التعديلات الجينومية: طريقة لتحديد الطفرات التي تم إنشاؤها بواسطة كريسبر في ذبابة الفاكهة

- عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى G0 بالغين ، اعبر جميع الذباب الفردي إلى مخزونات موازن مناسبة لتوسيع الخطوط المحررة المحتملة ل F1 CRISPR وتكون قادرا على تتبع وراثة التعديل الجيني. بعد ذلك ، قم بتهجين الذكور الفردية F1 المختارين عشوائيا إلى إناث موازن مناسبة ليتمكنوا من استعادة النسل إذا كان ذكر F1 إيجابيا للطفرة. بمجرد أن يأخذ الصليب ، انقل ذكر F1 إلى أنبوب للفحص.

لاستخراج الحمض النووي الجيني ، اسحق الذبابة بطرف ماصة يحتوي على مخزن مؤقت للاستخراج. بمجرد تكسير الأنسجة ، أخرج السائل. يحتوي المخزن المؤقت للاستخراج على بروتيناز K ، وهو إنزيم يهضم البروتينات في العينة ويتم تعطيله بالحرارة العالية.

الآن بعد أن أصبح الحمض النووي متاحا ، انتقل إلى فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). على سبيل المثال، استخدم البادئات المصممة لتضخيم منطقة تتضمن التسلسل الجديد. فقط في وجود التعديل ، سيتم تضخيم الارتباط التمهيدي الثاني ومنتج PCR. في المثال ، سنرى الذباب يتم تربيته وفحصه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال تسلسل التنشيط الذي يحل محل الإكسون الأول للجين عديم الفروع.

- عندما تتطور أجنة nos-Cas9 التي تم حقنها مسبقا بكل من بلازميد تعبير الحمض النووي الريبي الإرشادي والمتبرع البديل إلى بالغين ، يعبر G0 يطير بشكل فردي إلى الذباب الموازن من خط مناسب للأليل المستهدف. قم بتخدير نسل F1 من كل صليب