فحص التعديلات الجينومية: طريقة لتحديد الطفرات التي تم إنشاؤها بواسطة كريسبر في ذبابة الفاكهة

0 views • 3:48 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى G0 بالغين ، اعبر جميع الذباب الفردي إلى مخزونات موازن مناسبة لتوسيع الخطوط المحررة المحتملة ل F1 CRISPR وتكون قادرا على تتبع وراثة التعديل الجيني. بعد ذلك ، قم بتهجين الذكور الفردية F1 المختارين عشوائيا إلى إناث موازن مناسبة ليتمكنوا من استعادة النسل إذا كان ذكر F1 إيجابيا للطفرة. بمجرد أن يأخذ الصليب ، انقل ذكر F1 إلى أنبوب للفحص.

لاستخراج الحمض النووي الجيني ، اسحق الذبابة بطرف ماصة يحتوي على مخزن مؤقت للاستخراج. بمجرد تكسير الأنسجة ، أخرج السائل. يحتوي المخزن المؤقت للاستخراج على بروتيناز K ، وهو إنزيم يهضم البروتينات في العينة ويتم تعطيله بالحرارة العالية.

الآن بعد أن أصبح الحمض النووي متاحا ، انتقل إلى فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). على سبيل المثال، استخدم البادئات المصممة لتضخيم منطقة تتضمن التسلسل الجديد. فقط في وجود التعديل ، سيتم تضخيم الارتباط التمهيدي الثاني ومنتج PCR. في المثال ، سنرى الذباب يتم تربيته وفحصه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال تسلسل التنشيط الذي يحل محل الإكسون الأول للجين عديم الفروع.

- عندما تتطور أجنة nos-Cas9 التي تم حقنها مسبقا بكل من بلازميد تعبير الحمض النووي الريبي الإرشادي والمتبرع البديل إلى بالغين ، يعبر G0 يطير بشكل فردي إلى الذباب الموازن من خط مناسب للأليل المستهدف. قم بتخدير نسل F1 من كل صليب G0 على وسادة ثاني أكسيد الكربون واختر بشكل عشوائي من 10 إلى 20 ذكرا تحت مجهر ستيريو. اعبر كل ذكر تم اختياره بشكل فردي إلى أنثى موازن من خط مناسب للأليل المستهدف.

عندما تفقس يرقات F2 ، اختر الأب F1 من كل صليب. استخرج الحمض النووي الجيني عن طريق سحق كل ذبابة لمدة 10 إلى 15 ثانية بطرف ماصة يحتوي على 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للسحق دون الاستغناء عن المخزن المؤقت. ثم قم بتوزيع المخزن المؤقت المتبقي في الأنبوب واخلطه جيدا.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب في كتلة حرارية 95 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة لتعطيل البروتيناز K. بعد الدوران لمدة 5 دقائق عند 10,000 مرة جم ، قم بتخزين المستحضر على حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.

قم بإجراء شاشات ثلاثية الخطوات تعتمد على PCR باستخدام الاشعال للأمام 1 والخلف 1 للكشف عن وجود الإدخال أو الاستبدال. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات أمامية 2 وخلفية 2 للتحقق من الإدخال أو الاستبدال من ثلاث مناطق رئيسية. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال M13F والعكس 3 للتحقق من HDR النهائي.

- احتفظ بخطوط الطيران مع HDR المؤكد وقم بإنشاء مخزونات توازن من جيل F2. يطير الميزان مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى.

14:23

Recombineering مثلي التركيبات التوحد في ذبابة الفاكهة

Related Videos

0 Views

08:25

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

Related Videos

0 Views

11:27

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Related Videos

0 Views

05:48

النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Related Videos

0 Views

08:37

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

Related Videos

0 Views

10:00

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

Related Videos

0 Views

06:22

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

Related Videos

0 Views

07:46

CRISPR/Cas9 تحرير الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام علامة فحص dpy-10 Co-CRISPR ومجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة.

Related Videos

0 Views

06:37

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Related Videos

0 Views

08:19

بروتوكولات كريسبر / كاس 9 طفرات ذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية

Related Videos

0 Views

Last updated: 25 July 2026