الإزالة الميكانيكية لغشاء المشيمة والفيتيلين: طريقة لتحضير ذبابة الفاكهة للمراقبة المباشرة

- ابدأ بالبويضات الناضجة من المبايض الثابتة في محلول ملحي. تحمل البويضات الناضجة قشر البيض الذي يتكون من مشيمة خارجية وغشاء زجاجي داخلي.

لإزالة غشاء المشيمة والزجاجي ميكانيكيا ، ضع البويضات بين الأجزاء المتجمدة من شريحتين معالجتين مسبقا. حرك الشريحة العلوية بحركات مستقيمة ذهابا وإيابا لخلق احتكاك يلف البويضات.

الآن ، حرك الشريحة العلوية بزاوية طفيفة لدحرجة البويضات في اتجاه آخر. تجنب الحركة الدائرية، قم بزيادة هذه الزاوية بزيادات قصيرة حتى تتحرك الشريحة العلوية بشكل عمودي على الشريحة السفلية. تزيل هذه الحركة ميكانيكيا المشيمات والأغشية الزجاجية ، مما يتيح الوصول إلى المجسات أو البقع في البويضة.

ستظهر البويضات الخالية من المشيمات طويلة ورقيقة ، وتلك التي لا تحتوي على أغشية زجاجية سيكون لها نهايات مدببة. لفصل البويضات التي تم تطهيرها عن الحطام المحيط ، انقل مزيج العينة إلى أنبوب ، واترك البويضات تستقر في الأسفل بينما يطفو الحطام في الأعلى ويمكن إزالته.

في هذا البروتوكول ، سنقوم بإزالة أغشية المشيمة والفيتلين من بويضات ذبابة الفاكهة الناضجة.

- لفصل البويضات في المرحلة المتأخرة ، أضف أولا 1 مليلتر من PBSBTx إلى طبق تشريح ضحل. بعد ذلك ، استخدم P200 بطرف مطلي ب BSA لنقل المبايض الثابتة إلى الطبق الضحل. قم بتمرير المبايض لأعلى ولأسفل باستخدام طرف الماصة المطلي ب BSA لإخراج البويضات الناضجة من البويضات الأقل نضجا.

عندما يتم فصل البويضات في المرحلة المتأخرة بشكل كاف ، انقل كل الأنسجة إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 500 ميكرولتر. قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة باستور المسحوبة ، مع ترك حوالي 150 إلى 200 ميكرولتر في الأنبوب.

للتحضير لدرفلة البويضات ، قم بترطيب طبق عميق مسبقا مع 200 ميكرولتر من PBSBTx. غطي الطبق وضعيه جانبا.

احصل على ثلاث شرائح زجاجية بلورية واترك الشريحة ثلاثة جانبا. بعد ذلك ، افركي المناطق الزجاجية المصقولة برفق من الشرائح واحدة واثنتين معا. اشطفها بالماء منزوع الأيونات لإزالة أي شظايا زجاجية وجففها بمنديل يمكن التخلص منه. قم بتغطية المناطق المتجمدة من الشريحتين الأولى والثانية باستخدام PBSBTx عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من PBSBTx إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة بالشريحة الأخرى. قم بإزالة السائل بمنديل يمكن التخلص منه وضع الشرائح تحت مجهر تشريح. حافظ على اتصال المناطق المتجمدة من الشريحتين الأولى والثانية مع الشريحة الثالثة الداعمة للشريحة الثانية.

لدحرجة البويضات ، أولا ، قم بترطيب طرف ماصة P200 مسبقا في PBSBTx وتفريق البويضات في أنبوب الطرد الدقيق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل 50 ميكرولترا من السائل الذي يحتوي على البويضات إلى وسط الجزء الزجاجي المصنفر من الشريحة الأولى. ارفع الشريحة الثانية للقيام بذلك.

قم بخفض الشريحة الثانية ببطء حتى يخلق التوتر السطحي للسائل ختما بين منطقتي الزجاج المصنفر. يجب أن يكون هناك سائل كاف لتغطية المنطقة المتجمدة ، ولكن لا ينبغي أن يتسرب أي منها. بعد ذلك ، أمسك الشريحة السفلية في مكانها بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتحريك الشريحة العلوية اثنين للخلف وللأمام في اتجاه أفقي ، مع الحفاظ على الشريحة في المستوى الثاني ودعمها في الشريحة الثالثة.

قم بالأداء تحت المجهر لسهولة تصور حركات البويضات وتقدمها. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي ، قم بتغيير زاوية الحركة قليلا. بزيادات متعددة ، قم بزيادة هذه الزاوية تدريجيا إلى 90 درجة حتى تصبح حركة الشريحة العلوية الثانية عمودية على اتجاه البداية. لاحظ أن المشيمات الفارغة ستكون مرئية في السائل ، وستظهر البويضات التي تفتقر إلى المشيمات أطول وأرق.

- عند دحرجة البويضات ، تأكد من أن اتجاه التدحرج دائما في خط مستقيم وليس حركة دائرية أبدا.

- كرر التدحرج حوالي 7 إلى 10 مرات حتى يصبح المحلول غائما قليلا. توقف عن التدحرج عندما يبدو أن غالبية البويضات قد فقدت أغشية الزجاج.

ارفع الشريحة العلوية برفق ، واسحب إحدى أركانها إلى وسط المنطقة المصقولة في الشريحة السفلية حتى تتراكم البويضات الملفوفة في وسط المنطقة المصقولة. اشطف البويضات من كلتا الشريحتين باستخدام PBSBTx في طبق البئر العميق الذي يحتوي على PBSBTx.

نظف الشرائح الأولى والثانية بالماء عالي النقاء. يجف بمنديل يمكن التخلص منه وإعادة ضبطه. كرر هذه الخطوات حتى يتم لف جميع البويضات من نفس النمط الجيني. يتطلب هذا عادة ثلاث إلى أربع جولات من التدحرج لكل نمط جيني.

لإزالة الحطام بعد التدحرج ، أضف 1 مليلتر PBSBTx إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. حرك السائل لتغطية جوانب الأنبوب. باستخدام طرف ماصة P1000 المطلي ب PBSBTx ، انقل البويضات الملفوفة من طبق البئر العميق إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على 1 مليلتر من PBSBTx. أضف 2 مل إضافي من PBSBTx إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على البويضات.

أمسك الأنبوب المخروطي على خلفية داكنة لرؤية البويضات غير الشفافة أثناء غرقها. بعد ترك البويضات تستقر في القاع ، استخدم P1000 لإزالة أعلى 2 مل من المحلول الذي يحتوي على الحطام والتخلص منه.

بعد تكرار الخطوة لما مجموعه ثلاث جولات من إزالة الحطام ، استخدم طرف ماصة P1000 المطلي ب PBSBTx لنقل البويضات مرة أخرى إلى أنبوب الطرد الدقيق الأصلي سعة 500 ميكرولتر. يجب أن تنتج 20 إلى 25 أنثى ما يقرب من 50 ميكرولترا من البويضات الناضجة المدرفلة.