JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء
0 مشاهدات • 2:56 د • April 30th, 2023
- انقل C. ايليجانس المغسول في سائل إلى شريحة زجاجية مغلفة مسبقا بالبولي ليسين ، وهو مركب يساعد بشرة الدودة على الالتصاق بسطح الزجاج. اضغط برفق على شريحة زجاجية أخرى لأسفل مباشرة مع حافة متدلية فوق الشريحة السفلية. لشل حركة الديدان دون ضرر ، قم بضغط وتجنب أي حركات جانبية. بعد ذلك ، ضع الشرائح الزجاجية مع الديدان المحصورة على كتلة معدنية داخل حاوية مختبر معزولة مملوءة بعامل تجميد ، مثل النيتروجين السائل أو الثلج الجاف.
المعدن هو موصل فعال لدرجة الحرارة يضمن أن سطح الكتلة بارد بدرجة كافية لتجميد بشرة الدودة بسرعة على كلا السطحين الزجاجيين. بمجرد التجميد ، افصل الشرائح الزجاجية بسرعة لتفكيك بشرة الدودة أو فتحها. استمر في تثبيت الأنسجة وتلطيخها لأن تعطيل بشرة النفاذية المنخفضة يسمح للمثبتات الكيميائية والأجسام المضادة الملطخة بالوصول إلى أنسجة الدودة الداخلية. في البروتوكول التالي ، سنرى عرضا توضيحيا مفصلا لتقنية تكسير التجميد وتثبيت الأنسجة.
- أولا ، قم بإعداد شريحة لإصلاح الديدان. ماصة 30 ميكرولتر من بولي إل ليسين على شريحة ، ثم ضع شريحة ثانية على الأخرى وافركها معا لتوزيع المحلول بالتساوي على كليهما. الآن ، انزع الشريحتين واتركهما يجفان في الهواء لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، ضع كتلة معدنية مسطحة في وعاء مملوء بالنيتروجين السائل. اغسل الألواح بمحلول M9 وانقل حوالي 10 ميكرولترات من M9 التي تحتوي على الديدان. بدلا من ذلك ، اختر الديدان وأضف M9 إلى الشريحة.
بمجرد نقل الديدان ، قم بإسقاط مفترق الغطاء برفق عليها بحيث يتدلى الغطاء من حافة واحدة. ثم اضغط برفق على الغطاء دون القيام بأي حركات جانبية.
الآن ، انقل الشريحة على الفور إلى الكتلة المعدنية في النيتروجين السائل واتركها تتجمد. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة الغطاء باستخدام الحافة المتدلية. افعل ذلك بسرعة للحصول على الكراك المناسب للبشرة.
بعد ذلك ، اغمر الشريحة في وعاء زجاجي مملوء بالميثانول على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد خمس دقائق ، انقل الشريحة إلى وعاء كوبلن زجاجي مملوء بالأسيتون لمدة خمس دقائق أخرى بنفس درجة الحرارة. يمكن تلطيخ الشرائح مباشرة أو تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.