دودة واحدة PCR: طريقة لاستخراج وتضخيم الحمض النووي الجيني

- لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للدودة المفردة ، اسمح لدودة خنثى بالتخصيب الذاتي ووضع البيض الذي سينتج ذرية متطابقة وراثيا ، وبالتالي الحفاظ على نسخة من السلالة المعدلة. ثم انقل الوالد إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت لتحلل الدودة.

قم بتجميد الأنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لفتح البشرة أو الطبقة الخارجية. قم بتسخين العينة إلى زائد 60 درجة مئوية لتحلل الخلايا الدودية التي تطلق البروتينات داخل الخلايا جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الجيني للخلية. عند درجة الحرارة هذه ، يؤدي البروتيناز K داخل المخزن المؤقت إلى تحلل البروتينات ، وخاصة نوكليازات التي من شأنها أن تدمر الحمض النووي الجيني.

ثم ارفع درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية لتعطيل الإنزيم. أخيرا ، أضف محللة الخلية إلى أنبوب به مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل يتكون من مخزن مؤقت للتفاعل ، و dNTPs ، والبادئات الأمامية والخلفية للمنطقة ذات الأهمية ، وبوليميراز taq ، والماء لجلب التفاعل إلى الحجم النهائي المطلوب. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتشغيل برنامج التدوير الحراري المناسب الذي يضخم منطقة الحمض النووي ذات الاهتمام.

في المثال التالي ، سنرى إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن أحداث تحرير CRISPR-Cas9 في الحمض النووي الجيني لديدان F1 الفردية.

- بعد 1 إلى 2 أيام من وضع البيض ، استخدم صورة دودة لنقل F1s إلى أغطية أنبوب شريطية فردية PCR تحتوي على 7 ميكرولتر من محلول التحلل الدافئ. جهاز الطرد المركزي لأنابيب PCR بأقصى سرعة ودرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة لإحضار إلى قاع الأنبوب. ثم قم بتجميد الأنابيب عند سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بتحلل الديدان المجمدة في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي. بعد ذلك، قم بإعداد مزيج PCR الرئيسي كما هو موضح في هذا الجدول.

أضف 21 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي في أنابيب PCR النظيفة. ثم أضف 4 ميكرولترات من أنبوب تحلل الدودة واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات.

بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج PCR باتباع إرشادات الشركة المصنعة.