تفكك الخلية المفردة ل Caenorhabditis elegans: طريقة لعزل الخلايا الحية

0 مشاهدات4:51 د • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- ابدأ بالديدان المحببة المغسولة وأضف المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على SDS ، ومنظف ، و DTT ، وهو عامل اختزال. يؤدي هذا إلى تكسير بشرة الدودة الواقية مما يعرض الجسم لتفكك الخلايا. تجنب التعرض لفترات طويلة لمخزن التحلل لتقليل تحلل الخلايا وموتها.

بعد ذلك ، قم بإزالة كواشف التحلل بعدة غسلات من عازلة العزل البارد. من المهم أن يكون هذا المخزن المؤقت من الأسمولية الصحيحة لمنع موت الخلايا. استخدم إنزيم البروتياز لتحطيم اتصالات الخلية بالخلايا. ساعد في عملية التجانس جنبا إلى جنب مع الطاقة الميكانيكية عن طريق سحب الخليط على جدار الأنبوب.

أضف وسائط تحتوي على مصل لوقف تفاعل الإنزيم والمضادات الحيوية لمنع التلوث. بيليه وغسل العينة عدة مرات لإزالة معظم الحطام.

أخيرا ، ضع الأنبوب على الجليد للسماح بترسيب الجاذبية. سوف يستقر الحطام بما في ذلك بقايا البشرة أو كتل الخلايا ، بينما تظل الخلايا المنفصلة معلقة في الطبقة العليا من الوسائط. يمكن استخدام هذه الخلايا للزراعة قصيرة المدى أو لعزل مجموعات خلايا معينة عن طريق FACS أو الترسيب المناعي.

في مثال البروتوكول ، سنقوم بفصل الديدان المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية ذات الأهمية لعزل تلك الخلايا وتحليلها.

- بعد جمع ، قم بطردها بمعدل 1,600 مرة جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة كل المادة الطافية وأعد تعليق الديدان في 1 مليلتر من وسائط M9. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

جهاز طرد مركزي عند 1,600 مرة جم لمدة خمس دقائق لتكسير الديدان. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت SDS-DDT واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يجب أن تبدو الديدان الآن وكأنها مجعدة على طول الجسم إذا تم عرضها تحت المجهر الضوئي.

بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر من عازل العزل المثلج البارد واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب برفق. جهاز طرد مركزي عند 13,000 مرة جم وعند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة لتكسير الديدان. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها ب 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل.

كرر عملية الطرد المركزي والغسيل هذه ما مجموعه خمس مرات ، مع التأكد من إزالة عازلة العزل بعناية في كل مرة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من خليط البروتياز من Streptomyces griseus المذاب في عازلة عزلة ، إلى الحبيبات.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. تأكد من تطبيق التعطيل الميكانيكي عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من 60 إلى 70 مرة باستخدام طرف الماصة الدقيقة سعة 200 ميكرولتر على قاع الأنبوب. لتحديد مرحلة الهضم ، قم بإزالة 1 إلى 5 ميكرولتر من خليط الهضم ، وقم بإسقاطه على شريحة زجاجية ، وفحصه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة.

بعد خمس إلى سبع دقائق ، يجب أن يكون لشظايا الدودة بشرة مخفضة بشكل واضح وسيكون ملاط الخلايا مرئيا بسهولة. أوقف التفاعل بإضافة 900 ميكرولتر من وسيط Leibovitz L15 المتاح تجاريا مع 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين.

جهاز طرد مركزي عند 10,000 مرة جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لحبيبات الأجزاء والخلايا المعزولة. اغسل الخلايا المحببة مرتين أخريين باستخدام وسائط مكملة بتقنية L15 الباردة باستخدام 1 ملليلتر من الوسائط لكل غسلة. أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مليلتر من الوسائط المكملة L15 واتركها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، خذ الطبقة العليا ، التي تتراوح من 700 إلى 800 ميكرولتر تقريبا ، وانقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. استخدم عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم لقياس كثافة الخلايا من 10 إلى 25 ميكرولتر من الخلايا المعزولة.

11:01

العزلة وثقافة Neurospheres المستمدة الدماغ الكبار الزرد

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:29

العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

11:34

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:41

ج. ايليجانس تشريح الأريمة: طريقة لإزالة قشر البيض وفصل الخلايا الجنينية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:10

الهضم الأنزيمي والتفكك اليدوي: طريقة لتحضير C. ايليجانس الأجنة لزراعة الخلايا

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

02:10

عزل الخلايا العصبية عن Caenorhabditis elegans عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:10

منهج في التثقيف الجنينية C. ايليجانس خلايا

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:42

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:09

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:57

التشريح المجهري بالليزر لتطبيقات الأنسجة الأحادية التي لا تعرف الأنواع

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 1 أغسطس 2026