موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء
0 مشاهدة • 3:24 دقيقة • April 30th, 2023
- في C. ايليجانس، يمكن تحفيز الحمض النووي الريبي عن طريق تغذية بكتيريا الديدان التي تعبر عن الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة أو dsRNA من بلازميد الحمض النووي المؤتلف.
للبدء ، قم بزراعة HT115 الإشريكية القولونية المقاومة للتتراسيكلين المنقولة مع البلازميد L4440 بين عشية وضحاها على ألواح أجار LB الانتقائية التي تحتوي على التتراسيكلين والأمبيسلين ، أو الكربنيسيلين التناظري الوظيفي. بالإضافة إلى الحمض النووي المستهدف ، يحتوي البلازميد على جين لمقاومة الأمبيسلين. يمكن أن تنمو مستعمرات البكتيريا التي ترث البلازميد فقط في وجود هذه المضادات الحيوية.
بعد ذلك ، قم بحصاد مستعمرات البكتيريا وتوسيعها في وسط LB السائل إلى التركيز المطلوب. للحث على تعبير dsRNA ، انقل محلول البكتيريا إلى وسط نمو الديدان الخيطية المحضرة ، أو NGM ، ألواح أجار التي تحتوي على IPTG.
في نظام التعبير هذا ، يحاكي IPTG اللاكتوز لتعطيل مثبط lac الذي يتيح التعبير عن بوليميراز T7 RNA. على البلازميد ، يتم تنظيم تعبير الحمض النووي المستهدف بواسطة اثنين من محفزي T7 المتقاربين. وبالتالي ، يتم نسخ التسلسلات الحسية والمضادة للمعنى مما يؤدي إلى التعبير عن dsRNA.
أخيرا ، تستخدم الدودة معلومات التسلسل من dsRNA المبتلع لتقليل تنظيم mRNAs الذاتية مع التسلسلات التكميلية. في هذه التجربة ، سنقوم بإعداد ألواح RNAi مع بكتريا قولونية معدلة و
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية