تغذية الحمض النووي الريبي في الثقافة السائلة: طريقة عالية الإنتاجية للتخلص من التعبير الجيني في C. ايليجانس

- للبدء ، أضف الكربينسيلين و IPTG واحد مليمولار للتحكم في قوارير الثقافة التي تحتوي على الوسائط القاعدية S واختبارها. قم بتدوير أنبوب يحتوي على يرقات في مرحلة النمو الأولى ، وتسمى أيضا يرقات L1 ، لبضع دقائق. الآن قم بإزالة المادة الطافية وضع ميكرولترين من L1s على طبق أجار. ضع اللوحة تحت مجهر تشريح واحسب عدد اليرقات.

أضف بكتيريا RNAi التي تحمل بلازميد RNAi غير محدد إلى قارورة التحكم والبكتيريا ذات الحمض النووي الريبي الذي يستهدف الجينات إلى قارورة الاختبار. يجب أن تكون كمية البكتيريا المضافة متناسبة مع عدد الديدان.

دع اليرقات تنمو مع الاهتزاز المستمر لضمان الأكسجين المناسب. تتغذى اليرقات على البكتيريا. داخل اليرقة ، يرتبط الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل بالحمض النووي الريبي المرسال التكميلي الذي ينتجه الجين المستهدف ويمنع التعبير عن البروتين. أخيرا ، افحص الديدان بحثا عن النمط الظاهري الذي تهمك.

في مثال البروتوكول ، سنعالج يرقات L1 باستخدام RNAi الذي يستهدف جين daf-2 ، في الثقافة السائلة.

- لبدء العلاج ، أضف 207.45 مل من الوسائط القاعدية S مع كواشف إضافية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب إلى قارورة ثقافة Fernbach سعة 2,800 مل. أضف تركيزا نهائيا قدره 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الكاربينسيلين و 1 ملليمولار من IPTG ، وأغلق القارورة بغطاء لولبي غشائي

أخرج L1s من حاضنة 25 درجة مئوية وانقلها إلى أنابيب سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي L1s عند 1,900 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. بعد الغزل ، قم بإزالة المادة الطافية. تحت المجهر ، احسب L1s لكل ميكرولتر ، ومتوسط الأرقام التي تم الحصول عليها من تسع قطرات على الأقل.

بعد ذلك ، أضف 50,000 دودة لمجموعة الديدان الصغيرة و 100,000 دودة لمجموعة الديدان القديمة في أربع قوارير لثقافة فيرنباخ تم إعدادها في الخطوة السابقة. ثم أضف بكتيريا RNAi للتحكم وبكتيريا RNAi للجين ذي الأهمية بشكل متناسب مع عدد الديدان.

بعد إضافة البكتيريا ، أكمل زراعة الدودة باستخدام S قاعدية ليصل الحجم الإجمالي إلى 300 ملليلتر. احتضان مزرعة الدودة عند 25 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية ب 150 دورة في الدقيقة حتى التجميع.