الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة الحية: التسليم المبكر للكواشف إلى الجنين النامي

- اجمع أجنة ذبابة الفاكهة الحية وقم بإزالة مشالماتها غير الشفافة. ثم ، على غطاء زجاجي ، ضع خطا من غراء الهبتان ، وهو عبارة عن شريط لاصق مذاب في الهبتان السائل. لتتمكن من التعامل مع الأجنة المفككة الآن ، قم بمحاذاة العينات بعناية على التوالي على المادة اللاصقة.

انقل الغطاء إلى غرفة الجفاف لتجفيف الأجنة جزئيا. سيمنع هذا التسرب السيتوبلازمي أثناء الحقن أو بعده. بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء وقم بتغطية الأجنة بزيت الهالوكربون لمنع المزيد من الجفاف مع السماح للأكسجين بالانتشار في الأجنة.

لإجراء الحقن المجهري ، استخدم نظام الحقن المجهري على مجهر متوافق. من خلال النظر من خلال قطع العين ، حدد كل من الأجنة والإبرة المحملة مسبقا بمحلول الحقن. افتح الإبرة وتأكد من أنها تنتج قطرات سائلة متسقة وذات حجم مناسب. ثم أحضر الإبرة داخل الجنين وحقن الحجم المناسب. أخرج الإبرة ، وانتقل إلى الإبرة التالية ، وكرر الحقن للأجنة المتبقية.

في بروتوكول المثال ، سنرى عرضا توضيحيا للحقن المجهري لجنين ذبابة الفاكهة لدراسات التصوير الحي لانقسام الخلايا.

- قبل إعداد الغطاء ، قم بعمل غراء سباعي عن طريق فتح شريط لاصق مزدوج ، ووضعه في زجاجة سعة 100 مل. أضف حوالي 50 مل من الهبتان ، وأغلق الزجاجة ، وهزها لعدة أيام.

قبل تحضير الأجنة ، قم بعمل غرفة تجفيف يتم وضع الأجنة فيها قبل الحقن. للقيام بذلك ، ضع جزءا واحدا من طبق 35 ملم داخل طبق بتري 100 ملم لعمل "طاولة". أضف Drierite ، وهو كبريتات الكالسيوم اللامائية ، حوله بحيث لا يكون ارتفاع Drierite أعلى من "الطاولة" ، وقم بتغطيته.

لبدء تحضير الأجنة ، قم أولا بجمعها من القفص عن طريق تغيير طبق عصير العنب بالخميرة كل ساعة. يجب تصوير الأجنة بعد حوالي ساعتين من بدء الجمع. لتحضير الغطاء ، ضعه على جانب واحد من شريحة المجهر وقم بلصق الزوايا الأربع لأسفل حتى لا يتحرك.

باستخدام قضيب ذو رأس قطني ، ضع طبقة واحدة من غراء السباعي في خط على الغطاء. يجب ألا يكون الغراء لزجا ويجب أن يجف في بضع ثوان. إذا كانت سميكة جدا ، أضف المزيد من الهبتان.

أخيرا ، ضع قطعة من الشريط اللاصق المزدوج على الشريحة بجوار قسيمة الغطاء. باستخدام فرشاة مبللة ، التقط الأجنة بعناية من طبق عصير العنب وضعها على الشريط اللاصق المزدوج على الشريحة.

بعد ذلك ، استخدم نصف الملقط لدحرجة الأجنة فوق الشريط اللاصق المزدوج حتى ينفتح المشيمة. التقط الجنين عن طريق لفه برفق فوق المشيمة ، بحيث يلتصق بالملقط ، وضعه على غراء السباعي على الغطاء مع الجانب الطويل من الجنين الموازي للجانب الطويل من الغطاء.

ضع 10 إلى 20 جنينا في صف واحد. قم بإزالة الغطاء وضعه في حجرة التجفيف لمدة ثلاث إلى ثماني دقائق. يعتمد الوقت على الرطوبة المحلية والكمية المراد حقنها. بعد ذلك ، ضع الغطاء على غرفة معدنية مع شحم مفرغ. أخيرا ، قم بتغطية الأجنة بزيت الهالوكربون لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة جاهزة الآن للحقن.

أولا ، ابحث عن الأجنة تحت هدف 16X. حرك الأجنة بعيدا وابحث عن الإبرة دون تحريك المستوى البؤري. قم بتوسيط الإبرة وحركها لأعلى دون تحريكها في اتجاه X أو Y.

لفتح الإبرة ، ضع حافة الغطاء في مجال الرؤية ، ولكن ليس حيث ستكون الإبرة ، وقم بخفض الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. بحذر شديد ، حرك الغطاء حتى يصطدم بالإبرة ويفتحها برفق. حرك الإبرة لأعلى.

الآن اجعل الأجنة في العرض. اخفض الإبرة في الزيت ، وتأكد من الحصول على قطرات سائلة لطيفة من الإبرة. حرك الجنين بثبات إلى الإبرة ، وحقن قطرة في الجنين ، ثم حرك الجنين بعيدا. بعد حقن جميع الأجنة ، تكون جاهزة للمراقبة على مجهر متحد البؤر بهدف 60 أو 100X.