موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء
0 مشاهدة • 3:10 دقيقة • April 30th, 2023
- ابدأ بالبيض المحبب الذي تم عزله عن طريق تبييض الديدان البالغة الحاملة. تأكد من إجراء كل خطوة من خطوات هذا الإجراء بشكل معقم لتجنب تلوث الخلايا المستنبتة. الحبيبات في محلول من الكيتيناز ، وهو إنزيم يكسر الكيتين - وهو عديد السكاريد الكبير الذي يعد مكونا هيكليا لقشرة البيضة.
بعد فترة هضم مناسبة ، قم بالطرد المركزي للبويضات برفق واستبدل المادة الطافية بوسط زراعة الخلايا لوقف الهضم. بعد ذلك ، قم بتمرير الأجنة عبر إبرة قياس 18 لفصل الخلايا الفردية ميكانيكيا. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول لإزالة الحطام من قشرة البيض أو كتل الخلايا غير المنفصلة. ضع الخلايا في طبق استزراع على غطاء زجاجي مغطى بالرصة الفول السوداني - وهو ليكتين يساعد الخلايا على الالتصاق بزلة الغطاء عن طريق ربط الكربوهيدرات على سطح الخلية.
في مثال البروتوكول ، سنقوم بإعداد الخلايا الجنينية للتمايز والتحليل المورفولوجي في المختبر.
- أثناء العمل تحت غطاء التدفق الصفحي لتجنب إدخال التلوث البكتيري ، قم بتعليق البيض المحبب في مليلتر واحد من ملليغرامين لكل مليلتر من الكيتيناز وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. هز الأنبوب لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على نضارة الإنزيم. عندما يتم هضم ما يقرب من 80٪ من قشر البيض ، قم بالطرد المركزي للبيض على وزن 900 جم لمدة ثلاث دقائق.
بعد إزالة المادة الطافية بعناية ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط L15. انقل البيض إلى صفيحة قطرها ستة سنتيمترات وابدأ التفكك اليدوي باستخدام حقنة معقمة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 18. لمراقبة درجة التفكك ، ضع قطرة من التعليق في طبق بتري طازج واعرضها تحت المجهر. استمر حتى يتم فصل ما يقرب من 80٪ من الخلايا.
لإزالة كتل الخلايا والبيض غير المهضوم واليرقات المفرغة ، قم بتصفية المعلق برفق من خلال مرشح خمسة ميكرون وقم بتشغيل أربعة إلى خمسة ملليلتر إضافي من وسط L15 عبر المرشح لاستعادة الخلايا. لزراعة الخلايا بعد الطرد المركزي للمرشح عند 900 جم لمدة ثلاث دقائق ، أعد تعليق الخلايا في وسط L15 الكامل. ضع ملليلترا واحدا لكل بئر ، وقم بتخزين الأطباق في غرفة رطبة محكمة الغلق عند 20 درجة مئوية في الهواء المحيط.