موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء
0 مشاهدة • 2:23 دقيقة • April 30th, 2023
- ضع دودة معدلة وراثيا تعبر عن GCaMP - بروتين استشعار الكالسيوم - في غرفة التصوير جنبا إلى جنب مع الغذاء البكتيري للدودة. ثم أغلق الطبق بالغطاء وفيلم المختبر لمنع التبخر. شاهده تحت مجهر مركب مجهز للتألق الفائق المجال الواسع. سجل صور الفاصل الزمني للديدان لتتبع سلوكها والتقاط التألق باستخدام برنامج التصوير.
تعبر الديدان المعدلة وراثيا عن بروتين مستشعر GCaMP تحت سيطرة محفز يقود تعبير GCaMP في خلية عصبية معينة. عندما يتم تنشيط هذه الخلايا العصبية ، فإنها تطلق جهد فعل يزيل استقطاب غشاء البلازما. عند إزالة الاستقطاب ، تفتح قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي في غشاء البلازما. يؤدي هذا إلى تدفق أيونات الكالسيوم إلى الخلية ، مما يؤدي إلى إثارة الخلايا العصبية.
يربط GCaMP في الخلايا العصبية المثارة أيونات الكالسيوم. يتسبب هذا في تألق GCaMP عندما يتم تصوير الديدان بضوء إثارة مضان منخفض الكثافة. في مثال البروتوكول ، سنستخدم تصوير الكالسيوم لتصور نشاط الخلايا العصبية الداخلية AVA في C. ايليجانس المعدلة وراثيا في غرف الاغاروز الدقيقة.
- يتم إجراء تصوير الكالسيوم على مجهر مركب مجهز للتألق العرضي واسع المجال. للحد من التعرض للضوء، استخدم إشارة منطقية ترانزستور ترانزستور تؤدي إلى تشغيل مؤشر LED لإضاءة العينة في نفس الوقت الذي تسجل فيه الكاميرا إطارا.
قم بتشغيل فيلم متتابع لمدة 24 ساعة يصور كل دودة كل 15 إلى 30 دقيقة. أولا ، سجل 20 ثانية باستخدام DIC ، ثم 20 ثانية باستخدام مضان GFP ، وأخيرا ، صورة لإشارة mKate2 لمستويات التعبير التحكم.
لفحص البيانات المرئية ، استخدم خريطة ألوان خاطئة لتحسين رؤية التغييرات الصغيرة في شدة التألق. أخيرا ، قم بإجراء تحليل بيانات الكالسيوم باستخدام الإجراءات القياسية.