JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء
0 مشاهدات • 3:21 د • April 30th, 2023
- للبدء ، انقل الديدان الصغيرة إلى وسادة agarose طازجة على شريحة. ثم أضف بضع قطرات من محلول الليفاميزول 12 ملي مولار لشل الديدان. غطي الديدان بغطاء وانتظر بضع دقائق. ضع الشريحة تحت مجهر متحد البؤر القرص الدوار وركز على السطح الخارجي الجانبي للدودة.
بشرة الدودة البالغة عبارة عن بنية رقيقة أحادية الطبقة تتكون من مخلوية متعددة النوى ناتجة عن أحداث اندماج الخلايا. يفرز السطح القمي للبشرة بشرة كلاجينية مرنة ، بينما يتم تغطية السطح القاعدي بطبقة رقيقة من المصفوفة خارج الخلية تسمى الصفيحة القاعدية.
بعد ذلك ، جرح السطح القمي للبشرة بالليزر. قد يتسرب السيتوبلازم من الخلايا التالفة ، ويظهر كفقاعة في موقع الجرح.
يتميز التشعيع بالليزر بميزة على التقنيات الأخرى ، مثل جرح الإبرة ، لأنه يسبب اضطرابا موضعيا لخلايا البشرة والبشرة ، دون الإضرار بالأنسجة الداخلية. في مثال البروتوكول ، سنرى عملية الجرح بالليزر في C. ايليجانس.
- لجرح الديدان الخيطية بدقة ، يستخدم هذا البروتوكول ليزر فيمتو ثانية متصل بالمجهر متحد البؤر القرص الدوار. يجب أن تكون عمليات المسح الخطي أو النقطي باستخدام ليزر الفيمتو ثانية ، مثل تلك الموجودة في المجاهر ثنائية الفوتون ، كافية أيضا.
- ابدأ بجمع 10 شباب على وسادة أجار. قم بشل الشلل في قطرة ميكرولتر من محلول 12 ملي مولار من الليفاميزول. ثم قم بتغطيتها بقلة غطاء وانتظر بضع دقائق حتى تصاب بالشلل.
- من الضروري أن يصاب بالشلل التام. 12 ملي مولار لن يؤثر على استجابة الجرح. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام طرق أخرى للشلل.
- تأكد من ضبط طاقة ليزر الفيمتو ثانية على 140 مللي واط ، كما تم قياسها قبل الهدف ، وأن معدل تكرار الليزر عند 80 ميجاهرتز. الآن ، حدد موقع الديدان تحت مجهر متحد البؤر القرص الدوار. باستخدام هدف 100x بفتحة عددية عالية ، ركز على البشرة المخلوية الأمامية أو الخلفية الجانبية للدودة المستهدفة.
مع التركيز على السطح القمي لخلية البشرة ، قم بتلميع الليزر لمدة نبضتين 200 مللي ثانية مفصولة ب 20 مللي ثانية. يجب أن يكون هذا كافيا لجرح البشرة. انتظر لحظة ولاحظ الاضطراب الموضعي للسيتوبلازم ، والذي سيظهر على شكل فقاعات. في حالة وجود علامة الفلورسنت ، يمكن ملاحظة التبييض الموضعي.