وسادات الدهون الثديية المزيلة للخليات: اشتقاق هيدروجيلات المصفوفة خارج الخلية من وسادات الدهون الثديية

أولا ، ضع ضمادات دهون الثدي أو MFPs في طبق بمحلول Trypsin-EDTA واحتضانها لمدة المطلوبة لكسر التصاقات مصفوفة الخلايا. اغسل الطابعات متعددة الوظائف بالماء منزوع الأيونات وصفيها من خلال مصفاة. ضع المناديل في دورق مع شريط تقليب وأضف Triton X-100. يقلب لتحلل الخلايا دون التأثير على عوامل النمو في مصفوفة الأنسجة خارج الخلية.

صفي الطابعات متعددة الوظائف واشطفها بالماء منزوع الأيونات. انقل الأنسجة مرة أخرى إلى الدورق ، وأضف حمض الديوكسيكوليك لتحلل الخلايا المتبقية. بعد ذلك ، قم بتصفية الطابعات متعددة الوظائف وضعها في دورق يحتوي على ماء منزوع الأيونات مع البنسلين والستربتومايسين لمنع التلوث. احتضن الدورق عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

قم بتصفية الطابعات متعددة الوظائف وضعها في دورق يحتوي على الإيثانول وحمض البيراسيتيك. يزيد حمض البيراسيتيك من صلابة المصفوفة خارج الخلية للنسجة. يقلب لبعض الوقت ويكرر خطوة الإجهاد. اغسل الطابعات متعددة الوظائف باستخدام PBS ثم بالماء منزوع الأيونات. انقل الطابعات متعددة الوظائف المصفاة إلى دورق يحتوي على البروبان 1-ol.

قلبي لبعض الوقت ، وصفي المحتويات ، واغسل الطابعات متعددة الوظائف بالماء منزوع الأيونات. جفف الطابعات متعددة الوظائف واحفظها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء إزالة الخلايا من منصات دهون الثدي في الفئران.

أولا ، ضع الطابعات متعددة الوظائف في أطباق بحجم ستة سنتيمترات مع خمسة ملليلتر من محلول Trypsin-EDTA. رش الأطباق وامسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. استخدم مصافي 0.7 ملم لغسل الطابعات متعددة الوظائف بالماء منزوع الأيونات عن طريق سكب الماء على المنديل ثلاث مرات. استخدم الملقط لتدليك المناديل يدويا بين الغسل.

بعد ذلك ، جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة امسح ووزنها. ضع المناديل المجففة في دورق معقم مسبقا يحتوي على شريط تقليب بحجم مناسب ، وقم بتغطية الأنسجة ب 60 مل من 3٪ بولي إيثوكسي إيثانول تي أوكتيل فينوكسي لكل جرام من الأنسجة. يقلب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتفريغ محتويات الأكواب في مصفاة.

اشطف الدورق بالماء منزوع الأيونات واسكبه على الأنسجة. كرر عملية الشطف هذه مرتين أخريين ، مع التأكد من استخدام الملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين الشطف. بعد ذلك ، جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ، امسح ووزنها. ضع المناديل وقضبان التحريك مرة أخرى في نفس الأكواب وقم بتغطيتها ب 60 مل من 4٪ حمض الديوكسيكوليك لكل جرام من الأنسجة. يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

بعد ذلك ، قم بتفريغ محتويات الدورق في مصفاة شبكية. اشطف الدورق بالماء منزوع الأيونات واسكبه على الأنسجة. كرر عملية الشطف هذه مرتين أخريين ، مع التأكد من استخدام الملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين الشطف. جفف الأنسجة المغسولة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ، وامسحها ووزنها.

ضع الأنسجة المجففة في نفس الدورق مع الماء الطازج منزوع الأيونات المكمل بستربتومايسين 1٪ بنسلين. غطي الدورق بإحكام بغشاء البارافين واتركيه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، صفي محتويات الدورق في مصفاة. جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ، امسحها ووزنها. بعد ذلك ، ضع الطابعات متعددة الوظائف في نفس الدورق بشريط تقليب بحجم مناسب.

قم بتغطية الأنسجة ب 60 مل من محلول يحتوي على 4٪ إيثانول و 0.1٪ حمض بيراسيتيك لكل جرام من الأنسجة. يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. قم بتفريغ محتويات الدورق في مصفاة 0.7 ملم. استخدم الملقط لتدليك المناديل يدويا وإعادة المحتويات إلى الدورق مرة أخرى. اغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها ب 60 مل من 1X PBS لكل جرام من الأنسجة.

يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل بأكملها مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتفريغ محتويات الدورق في مصفاة 0.7 ملم. باستخدام الملقط ، قم بتدليك الأنسجة يدويا ووضع المحتويات مرة أخرى في الدورق اغسل الأنسجة بتغطيتها ب 60 مل من الماء منزوع الأيونات لكل جرام من الأنسجة.

يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل بأكملها مرة أخرى. جفف الأنسجة المغسولة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ، امسح ووزنها. قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة واستخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق وقم بتغطية الأنسجة ب 60 مل من 100٪ n-propanol لكل جرام من الأنسجة.

يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. ثم جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ووزنها. قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم واستخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق واغسل المنديل بتغطيته ب 60 مل من الماء منزوع الأيونات لكل جرام من الأنسجة.

يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات. بعد ذلك ، جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة دقيقة ، امسح وزنها. انقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مليلتر وقم بتجميدها عند سالب 80 درجة مئوية طوال الليل.