فحص XTT: اختبار لوني لتقييم بقاء الخلية ونشاط الميتوكوندريا

- تؤدي الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد إلى التحلل الانتقائي لخلايا ابيضاض الدم البشرية ويساعد اختبار XTT في تحديد درجة هذا الضرر. يعمل الاختبار على مبدأ أن إنزيمات الميتوكوندريا للخلايا السليمة تحول صبغة XTT الصفراء إلى مركب برتقالي يسمى الفورمازان. لبدء الفحص ، عالج الخلايا بميثيل بيتا سيكلودكسترين ، وهو عامل مستنفد للكوليسترول ، ثم قم بصوتنة الخلايا بطاقة منخفضة للحث على تلف الخلايا.

جهاز طرد مركزي لتكوير الخلايا وإضافة وسائط نمو الخلايا الطازجة إلى الحبيبات. قم بزرع الخلايا بالتركيز المطلوب في صفيحة دقيقة متعددة الآبار واحتضانها طوال الليل. الآن ، أضف محلول XTT المنشط إلى الخلايا واحتضنه حتى يتطور اللون البرتقالي في آبار الصفيحة الدقيقة. ضع اللوحة في مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس الامتصاص من 450 إلى 500 نانومتر ثم عند 630 إلى 690 نانومتر. اطرح القيمتين للحصول على نتائج دقيقة. تشير القيمة الأعلى للامتصاص في اختبار XTT إلى النشاط العالي لإنزيمات الميتوكوندريا وزيادة قابلية الخلية للبقاء.

في الفيديو التالي ، سنوضح استخدام مقايسة XTT لتحديد فعالية الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد في إحداث تلف الخلايا في خلايا سرطان الدم المعالجة بميثيل بيتا سيكلودكسترين.

- لتقييم جدوى الخلايا الصوتية عن طريق اختبار XTT ، قم بصوتنة الخلايا باستخدام مجموعة من نبضات مدتها ثانية واحدة ، على أساس ثانية واحدة ، لتطوير مجموعة من الضرر لمجموعة XTT لتقييمها. ثم قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الكريات إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في وسط النمو المعد حديثا. بعد ذلك ، قم بزرع 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في 96 لوحة ميكروتيتر فردية مسطحة القاع في ثلاث نسخ ، بما في ذلك ثلاثة آبار تحكم تحتوي على 100 ميكرولتر من وسط النمو الكامل وحده لقراءات الامتصاص الفارغة. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.

في صباح يوم الفحص ، قم بتدوير الأجزاء برفق من XTT الدافئ بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وكواشف التنشيط حتى تصبح المحاليل واضحة. ثم أضف 0.1 ملليلتر من كاشف التنشيط إلى 5 ملليلتر من كاشف XTT. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول XTT المنشط إلى كل بئر من الألواح الملقحة U937 و THP1 وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد ساعتين ، رج الألواح برفق لتوزيع الصبغة البرتقالية بالتساوي في الآبار الموجبة وقياس الامتصاص على قارئ لوحة ميكروتيتر بين 450 و 500 نانومتر. أخيرا ، قم بقياس امتصاص جميع آبار الفحص مرة أخرى بين 630 و 690 نانومتر.