مقايسة وضع العلامات على نبض برومودوكسيوريدين: تقنية لقياس تكاثر الخلايا
JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 3:59 د • April 30th, 2023
- ابدأ بتعليق خلايا ابيضاض الدم الذي يحتوي على كثافة الخلايا المطلوبة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في وسط مزرعة يحتوي على المصل. تعزز إضافة المصل النمو المستمر للخلايا وتتحرك الخلايا عبر مراحل دورة الخلية المختلفة. قم بتخفيف الخلايا في محلول الملصقات برومودوكسي يوريدين ، أو BrdU ، وزراعتها في ظل ظروف فسيولوجية للمدة المطلوبة.
تأخذالخلايا في التخليق أو المرحلة S BrdU - نظير الثايميدين - الذي يحل محل الثايميدين أثناء عملية تكرار الحمض النووي. الطرد المركزي للخلايا لإزالة BrdU الزائد وإعادة تعليق الخلايا في وسط مناسب. انقل الخلايا إلى لوحة آبار متعددة. اسمح للخلايا بالنمو في ظل ظروف فسيولوجية لفترات زمنية مختلفة.
في فترات زمنية مختلفة ، تتقدم الخلايا خلال ما تبقى من مراحل S و G2 والانقسام الفتيلي و G1 وتدخل في دورة الخلية التالية ، مما يسمح بتقدير تكاثر الخلايا. قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة لتمييز BrdU بالجسم المضاد الفلوري وقياس تكاثر الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
داخل مقياس التدفق الخلوي ، تمتص الفلوروكرومات طاقة الليزر والفلوريس. يرتبط عدد الخلايا المتكاثرة ارتباطا مباشرا بالتألق الذي لوحظ. في مثال البروتوكول ، سنوضح وضع العلامات النبضية لخلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد.
- يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد ، NALM6 ، ولكن يمكن تطبيقه على أي خط خلوي غير ملتصق. حافظ على خلايا NALM6 في قوارير مزرعة T-75 في RPMI كامل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء. بعد جمع الخلايا وإجراء تعداد الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في RPMI كامل عند 2 في 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر.
قم بتخفيف الخلايا 1 في 2 باستخدام BrdU Complete RPMI لإنتاج تركيز خلية نهائي 1 في 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر. تعامل مع BrdU بحذر لأنه مطفر محتمل ومطيسان. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا 1 في 10 باستخدام RPMI الكامل. جهاز طرد مركزي عند 150 مرة G لمدة خمس دقائق وتخلص بعناية من كل المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في حجم صغير من RPMI الكامل ، وقم بإجراء عدد الخلايا ، واضبط تركيز الخلية إلى 1 في 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر. ماصة 1 مليلتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة 48 بئرا.
ماصة 1 مليلتر من DPBS في أي آبار غير مأهولة للحصول على نتائج أكثر قابلية للتكرار. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الهواء للنقاط الزمنية المطلوبة ، اعتمادا على ما يهدف التصميم التجريبي إلى قياسه. عند اكتمال الحضانة ، انقل جميع الخلايا إلى أنابيب FACS.
اشطف كل بئر بالتتابع بأحجام 1 مليلتر من PBS إلى الحجم الإجمالي النهائي 5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 150 مرة G لمدة خمس دقائق وإزالة كل المادة الطافية بعناية. الخلايا جاهزة الآن للتلوين ، والتي يجب إجراؤها على الفور. إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ السطح ، فيجب إجراؤه الآن ، قبل التثبيت.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتقييم تكاثر الخلايا في خلايا سرطان اللوكيميا اللمفاوية الحادة باستخدام وسم BrdU وقياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة للباحثين بتقدير تقدم الدورة الخلوية ومعدلات التكاثر في الخطوط الخلوية غير الملتصقة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الأورام
- قياس التدفق الخلوي
خلفية علمية
- يعتبر BrdU نظيراً للثيميدين يُستخدم لوسم الخلايا في طور S من دورة الخلية.
- يتيح قياس التدفق الخلوي تقدير كمية الخلايا الموُسّمة بناءً على الفلورية.
- يعد فهم تكاثر الخلايا أمراً بالغ الأهمية لأبحاث السرطان وتطوير العلاجات.
- يُعد سرطان الدم الليمفاوي الحاد نوعاً شائعاً من سرطان الدم لدى الأطفال.
الغرض من الدراسة
- توضيح طريقة لوسم وقياس كمية خلايا اللوكيميا المتكاثرة.
- توفير بروتوكول قابل للتكرار للباحثين الذين يعملون مع خطوط خلوية غير ملتصقة.
- تسهيل دراسة ديناميكيات الدورة الخلوية في أبحاث السرطان.
الطرق المستخدمة
- تحضير معلق الخلايا وعملية الطرد المركزي.
- وسم الخلايا بـ BrdU متبوعاً بالتحضين.
- استخدام قياس التدفق الخلوي لقياس تكاثر الخلايا.
- التصبيغ بالأجسام المضادة لوسم BrdU بجسم مضاد فلوري.
النتائج الرئيسية
- الوسم الناجح للخلايا في طور S باستخدام BrdU.
- التقدير الكمي للخلايا المتكاثرة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- إثبات تقدم الدورة الخلوية في خلايا سرطان الدم اللمفاوي الحاد.
- بروتوكول قابل للتطبيق على مختلف الخطوط الخلوية غير الملتصقة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة تكاثر الخلايا.
- يعتبر وسم BrdU المقترن بقياس التدفق الخلوي فعالاً لتحليل ديناميكيات الدورة الخلوية.
- يمكن لهذا النهج أن يعزز فهم بيولوجيا خلايا اللوكيميا.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يُعد قياس تكاثر الخلايا أمراً بالغ الأهمية لتقييم الفعالية العلاجية والحد من المخاطر الميكانيكية في عملية اكتشاف أدوية الأورام. يتيح اختبار وسم BrdU النبضي التتبع الكمي للدخول في طور S دون الحاجة إلى مزامنة الخلايا، مما يدعم التقييم القابل للتكرار لتأثيرات المركبات على تقدم الدورة الخلوية. ويوفر هذا النهج ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف من خلال ربط قراءات التكاثر بالفرضيات الميكانيكية في ابيضاض الدم ونماذج الأمراض التكاثرية الأخرى.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس تخليق DNA في مجموعات خلوية محددة.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال القياس المباشر للتغيرات في التكاثر عند تعديل المسارات.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز المحافظ الدوائية من خلال تقليل المخاطر الميكانيكية للمركبات المضادة للتكاثر.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تنتج مخرجات فلورية كمية وموحدة متوافقة مع قياس التدفق الخلوي للفحص عالي المحتوى.
- إمكانية التكرار: تمنع ظهور الآثار الاصطناعية الناتجة عن التزامن، مما يحسن من متانة المقايسة عبر المكررات والخطوط الخلوية.
- القابلية للتوسع: قابلة للتكيف مع تنسيقات الأطباق متعددة الآبار لتحديد ملفات الاستجابة للجرعة في حملات تحديد المركبات الرائدة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: قابلة للتطبيق المباشر على نماذج سرطان الدم (leukemia)، مما يتيح مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية مع مؤشرات التكاثر السريرية.
- الاستمرارية قبل السريرية: تجسر الفجوة بين التحقق من الآلية في مرحلة الاكتشاف وتقييمات الفعالية قبل السريرية من خلال مقاييس تكاثر متسقة.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: توفر معلومات لمعايير المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) عن طريق قياس آثار ارتباط الهدف في تقدم الدورة الخلوية.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
يتناسب هذا المقايسة ضمن سلسلة الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، حيث توفر بيانات الانتشار التي تساهم في الفهم الميكانيكي وعلاقات البنية بالنشاط.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس جزء طور S كمؤشر وظيفي لنشاط المسار.
- الفحص: يوفر مخرجات كمية جاهزة للمقايسة لتقييم مكتبات المركبات في المزارع المعلقة.
- التحليلات: يولد مقاييس تكاثر مرتبطة بالفلورة تتيح مقارنة الظروف وتحديد EC50.
- الأبحاث الانتقالية: يربط العمل بالدراسات قبل السريرية من خلال ديناميكيات دورة الخلية المحفوظة في عينات ابيضاض الدم الأولية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة تكاثر قابلة لإعادة الاستخدام يمكن تطبيقها عبر المجالات العلاجية للأورام والمناعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فحوصات التكاثر.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي من خلال الوسم المعتمد على الدقة الزمنية وبدون الحاجة إلى المزامنة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين التخفيف المبكر لمخاطر الآليات المثبطة للخلايا.
- التأثير على المحفظة: تدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر عبر عتبات تكاثر كمية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي وتقنيات الكشف القائمة على الأجسام المضادة.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي ذات قنوات كشف الفلورة المناسبة.
- يستلزم بروتوكولات موحدة للتعامل مع BrdU نظرًا لخصائصه المسببة للطفرات والتشوهات الجنينية.
- يتضمن تحسين مدة النبضة وأوقات المطاردة ليتناسب مع حركية خطوط خلوية محددة.
- يقتصر على المجموعات الخلوية التي تمر بمرحلة التكاثر؛ بينما تتطلب الخلايا الساكنة أو الهرمة اختبارات تكميلية.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تلطيخ التألق المناعي BrdU: تقنية لتحديد الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
مقايسة تخليق الحمض النووي: تقنية لتقييم تخليق الحمض النووي في الخلايا المتكاثرة باستخدام دمج الثايميدين المثيل المشع
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026