JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 3:18 د • April 30th, 2023
- أولا ، أمسك الفأر المخدر من رقبته وقم بإبراز العين. أدخل أنبوبا شعريا دقيقا في القناة الإنسية للعين. اسمح للدم بالتدفق عن طريق العمل الشعري في أنبوب. انقل الدم إلى أنبوب مغطى ب EDTA واحتفظ به على الجليد. يربط EDTA أيونات الكالسيوم ، مما يمنع تخثر الدم. تقلل درجة الحرارة المنخفضة من نشاط تحلل السكر للخلايا وفرص التلوث الميكروبي.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الدم بمخزن مؤقت يحتوي على EDTA واخلطه جيدا. أضف بعناية طبقة من محلول الفصل المناسب إلى القاع ، دون إزعاج الدم. الطرد المركزي التعليق. يجمع البوليمر الموجود في محلول الفصل خلايا الدم الحمراء والرواسب في الأسفل. الخلايا والصفائح الدموية أحادية النواة ، كونها أخف من البوليمر ، ترسب فوق التدرج البوليمري.
قم بإزالة الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما واجمع الحلقة البيضاء غير الشفافة التي تحتوي على خلايا أحادية النواة. قم بتخفيف الخلايا باستخدام PBS وأجهزة الطرد المركزي لإزالة البلازما والصفائح الدموية المتبقية. استخدم الخلايا أحادية النواة المعزولة لمزيد من التحليل. سيوضح البروتوكول التالي عزل الخلايا أحادية النواة عن فأر متولد الولادة يتم حقنه بخط خلية سرطان الدم C1498.
- أدخل أنبوبا شعريا في القناة الإنسية لعين المصاب بسرطان الدم المخدر. سيتم سحب 100 إلى 200 ميكرولتر من الدم من الجيب الحجاجي إلى الأنبوب الشعري. قم بإزالة الأنبوب والتحكم في النزيف بالتطبيق اللطيف لإسفنجة شاش معقمة على العين. بعد ذلك ، انقل الدم إلى أنبوب EDTA وقم بتخزين الأنبوب على الجليد حتى عزل الخلية أحادية النواة.
لعزل خلايا الدم أحادية النواة ، أضف أولا PBS مكملا ب 1 مللي مولار EDTA حتى حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر. ثم انقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 1 مليلتر مزودة بإبرة قياس 30 لوضع 500 ميكرولتر من محلول الفصل تحت الدم بعناية ، مع الحرص على عدم خلط الطبقات.
افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي واستخدم ماصة لنقل طبقة الخلية البيضاء أحادية النواة غير الشفافة إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ثم اغسل الخلايا المناعية في 1 مليلتر من PBS. قم بالطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للتلوين والتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.