الطرد المركزي المتدرج الكثافة: طريقة لعزل خلايا CLL من الدم المحيطي

- في مرضى ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن ، أو مرضى CLL ، تزداد الخلايا الليمفاوية للخلايا البائية بشكل كبير في نخاع العظام والدم. لعزل خلايا CLL هذه من عينة الدم ، أولا ، عالج العينة بمزيج تخصيب الخلايا البائية البشرية الذي يفصل الخلايا البائية باستخدام الانتقاء السلبي. تتعرف الأجسام المضادة الموجودة في الكوكتيل على وجه التحديد على المستضدات التي تعبر عنها الخلايا غير البائية وكريات الدم الحمراء وتربط بينها ، وتشكل مجمعات كثيفة.

بعد ذلك ، ضع العينة فوق وسط متدرج الكثافة بكثافة مثالية لعزل الخلايا الليمفاوية. مع الطرد المركزي اللاحق ، تنفصل مكونات الدم المختلفة بناء على الاختلافات في كثافتها بالنسبة إلى وسط التدرج. تستقر مجمعات الخلايا الحمراء غير البائية ذات الكثافة العالية من خلال الوسط ، وتشكل حبيبات. يشكل جزء البلازما الأقل كثافة الطبقة العليا. تشكل خلايا CLL الأقل كثافة طبقة بيضاء عند الواجهة المتوسطة ذات كثافة البلازما.

انقل الطبقة البيضاء بعناية إلى أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي مرة أخرى للحصول على حبيبات تحتوي على خلايا CLL منقاة. في البروتوكول التالي ، نعرض عزل خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن ، من عينات دم المريض.

- الحصول على عينات دم محيطية من مرضى ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن المتفق عليهم مسبقا في أنابيب جمع الدم EDTA مصحوبة بعدد الخلايا البيضاء.

- يجب اعتبار عينات الدم البشرية خطرة ، لأنها يحتمل أن تحتوي على فيروسات منقولة بالدم. يرجى التأكد من التعامل مع هذه العينات في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية وأن المستخدم يرتدي معطف مختبر وقفازات في جميع الأوقات. تخلص من المواد الملوثة بالدم وقم بتطهيرها.

- إذا كان عدد الخلايا البيضاء يساوي أو يزيد عن 40 مليون خلية لكل مليلتر ، فقم بتخفيف العينة بنسبة 1 إلى 1 باستخدام المخزن المؤقت للغسيل RT CKL. ثم قم بنقل متوسط التدرج بكثافة RT في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل مناسب للعينة. ضع العينة بعناية فوق الوسط وجهاز الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة 30 دقيقة في RT.

باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، قم بحصاد الطبقة البيضاء من الخلايا أحادية النواة التي تجمعت برفق عند واجهة وسط تدرج الكثافة ومخزن غسيل LL. انقل هذه الطبقة الأحادية المعزولة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل جديد سعة 50 مل. لغسل الخلايا ، أضف 40 مل من مخزن غسيل CLL إلى هذه الطبقة الأحادية وجهاز الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من المادة الطافية ، ونفض الغبار أسفل الأنبوب لإعادة تعليق الحبيبات ، وكرر هذا الغسيل. تخلص من المادة الطافية ، وقم بنفض الغبار عن الجزء السفلي من الأنبوب مرة أخرى ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في حجم محدد من المخزن المؤقت للغسيل CLL ، اعتمادا على حجم الحبيبات. بعد عد الخلايا وبعد قياس التدفق الخلوي للتحقق من نقاء الخلية ، ضع الخلايا في ألواح زراعة الأنسجة بكثافة الخلايا المطلوبة ، جاهزة للتحفيز ، أو العلاج الدوائي.