مقايسة التدفق خارج الخلية: طريقة لقياس المظهر الأيضي للخلايا

- يساعد مقايسة التدفق خارج الخلية في دراسة عملية التمثيل الغذائي للخلية عن طريق قياس مسارين رئيسيين للطاقة - تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا. أثناء تحلل السكر ، تقوم الخلايا باستقلاب الجلوكوز وإفراز اللاكتات في الفضاء خارج الخلية جنبا إلى جنب مع البروتونات ، والتي يتم تحديدها عن طريق قياس معدل التحمض خارج الخلية أو ECAR. أثناء تنفس الميتوكوندريا ، تستخدم الخلايا الأكسجين لإنتاج ATP ، والذي يقاس بتحديد معدل استهلاك الأكسجين أو OCR.

تظهر الخلايا السرطانية امتصاصا مرتفعا للجلوكوز لأنها تغير معدل الأيض للتكيف والحفاظ على التكاثر الخلوي غير المنظم. لتحليل التمثيل الغذائي في الخلايا السرطانية ، قم أولا بتجميع صفيحة دقيقة لتحليل التدفق تحتوي على طبقة أحادية للخلايا السرطانية الملتصقة وخرطوشة مستشعر رطبة. انقل مجموعة اللوحة إلى محلل التدفق. داخل المحلل ، تنزل مجسات المستشعر لإنشاء غرفة صغيرة عابرة. لقياس التدفق خارج الخلية ، يقوم منفذ الحقن بإدخال مركبات الاختبار في الصفيحة الدقيقة في نقاط زمنية محددة مسبقا.

بناء على التمثيل الغذائي للخلايا ، تتقلب تركيزات الأكسجين المتاح والبروتونات المنبعثة في الغرفة الدقيقة. يستشعر اثنان من الفلوروفورات المضمنة في قاعدة الخرطوشة ويقيسانها في وقت واحد مستويات الأكسجين والبروتون ، مما يدل على تنفس الميتوكوندريا وتحلل السكر ، على التوالي. في البروتوكول التالي ، سنعرض مقايسة التدفق خارج الخلية لقياس النشاط الأيضي لخلايا سرطان الدم الأولية.

- في هذه الأثناء ، لتحضير الألواح لتحليل التدفق خارج الخلية ، أضف 12.5 ميكرولترا من محلول لاصق الخلية في كل بئر من لوحين لمحلل التدفق خارج الخلية بسعة 8 آبار. بعد 20 دقيقة ، قم بسحب لاصق الخلية وغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم لكل غسلة.

بعد الغسيل الثاني ، اترك الألواح في الغطاء حتى تجف الآبار ، وضع خرطوشة المستشعر رأسا على عقب على مقعد المختبر. افصل لوحة المرافق وخرطوشة المستشعر الخاصة بمحلل التدفق ، واملأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من العيار وكل خندق حول الجزء الخارجي من الآبار ب 400 ميكرولتر من الفرجار.

أعد خرطوشة المستشعر إلى لوحة المرافق التي تحتوي الآن على الفرجار ، وضع مجموعة الخرطوشة في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. ثم قم بتشغيل محلل التدفق خارج الخلية واتركه دافئا إلى 37 درجة مئوية طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، انقل الخلايا من القارورة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق الكريات في 1 مليلتر من الوسط التجريبي المناسب للعد. أعد تعليق الخلايا في 4 مرات 10 إلى 6 خلايا في 400 ميكرولتر من تركيز الوسط التجريبي وأضف 50 ميكرولترا من الخلايا في الآبار B إلى G من لوحة محلل التدفق ، و 180 ميكرولترا من الوسط التجريبي في الآبار A و H كآبار التحكم في الخلفية.

بعد الطرد المركزي ، أضف ببطء وحذر 130 ميكرولترا من الوسط التجريبي إلى الآبار من B إلى G ، وتأكد بصريا من الالتصاق المستقر للخلايا بقاع كل بئر تحت المجهر. ثم أعد لوحة تحليل التدفق إلى الحاضنة المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.

قبل 20 دقيقة من نهاية الحضانة ، قم بتحميل المركبات في منافذ الحاقن المناسبة للخرطوشة وفقا للبروتوكول التجريبي ، كما هو موضح في الجدول. ثم قم بإعداد برنامج تحليل التدفق خارج الخلية المناسب. ابدأ البرنامج، واستبدل لوحة العيار بلوحة الفحص عندما يطلب منك ذلك.