قص الكروماتين: طريقة لتوليد شظايا الكروماتين باستخدام الهضم الأنزيمي

- عوامل النسخ هي بروتينات ترتبط بموقع معين على الحمض النووي لتنظيم التعبير الجيني. تغير الأخطاء في عوامل النسخ هذا النشاط ، مما يؤدي إلى الإفراط في التعبير عن الجينات ، مما يسبب السرطان. لفهم دور عوامل النسخ وتنظيم الجينات ، يمكننا إجراء مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين أو CHIP ، ويعد قص الكروماتين خطوة مهمة في سير عمل CHIP.

لقص الكروماتين ، قم بتثبيت مركب بروتين الحمض النووي عن طريق إضافة الفورمالديهايد. يربط الفورمالديهايد البروتينات بتسلسل الحمض النووي المرتبط عن طريق تكوين روابط تساهمية. بعد ذلك ، استخدم عازلة تحلل مناسبة لتحلل الخلايا لإطلاق الكروماتين الذي يحتوي على مجمعات بروتين الحمض النووي المتشابكة وأجهزة الطرد المركزي. قص الكروماتين باستخدام إنزيم نوكلياز المكورات الدقيقة. يشق هذا الإنزيم الكروماتين بين النيوكليوسومات ويهضم نهايات الحمض النووي السائبة. الطرد المركزي الخليط وجمع المادة الطافية.

قم بتحميل المادة الطافية على هلام الاغاروز TBE لتحليل الحجم المناسب لشظايا الحمض النووي. ضع مجالا كهربائيا عبر الجل ، مما يؤدي إلى تحرك الحمض النووي للكروماتين سالب الشحنة نحو الأنود. تتحرك الأجزاء الأصغر إلى أسفل الجل. يظهر الكروماتين المنفصم على شكل مسحة في الجل. في البروتوكول التالي ، سنقوم بقص الكروماتين لخط خلايا سرطان الدم النخاعي المزمن باستخدام الصوتنة.

- للبدء ، املأ أنبوبا مقاس 1.5 ملم ب 1 مليلتر من 37٪ فورمالديهايد. بعد ذلك ، املأ أنبوبا آخر سعة 1.5 ملليلتر ب 1 مليلتر من 1.25 مولار جلايسين وأنبوب 5 مليلتر ب 4 ملليلتر من PBS. بعد ذلك ، بعد تحفيز الخلايا ، قم بتدوير الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وضع الأنبوب في صندوق مملوء بالثلج. أضف 13.5٪ ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد إلى الخلايا واخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.

ثم احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 57 ميكرولترا من 1.25 مولار جلايسين لإيقاف التثبيت والسماح لهذا التعليق بالحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد فترة الحضانة ، ضع الخلايا على الجليد وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم استنشق المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مليلتر من PBS المثلج البارد عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 ملليلتر من محلول التحلل -1 عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

ثم ضع العينات على الثلج واحتضانها مع الرج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، استخدم الماصة لإزالة المادة الطافية بعناية. قم بتجانس الخلايا في 5 ملليلتر من محلول التحلل -2 والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق مع الرج. بعد فترة الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في القص العازل -1 باستخدام مثبط البروتياز 1X. ثم احتضان معلق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق. انقل 140 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى أنابيب الصوتنة ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات الهواء. ضع الأنابيب في جهاز الموجات فوق الصوتية المركز عند 7 درجات مئوية وقصها لمدة عشر إلى سبع دقائق ونصف. نقل تعليق الخلية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للعينات عند 15,700 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد.