مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين: تقنية لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا

- ترسيب مناعي للكروماتين ، أو ChIP ، هو تقنية تستخدم لتحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا. ترتبط البروتينات بمواقع محددة على الحمض النووي وتنظم التعبير الجيني. أولا ، قم بتثبيت مركب بروتين الحمض النووي بالفورمالديهايد. يربط الفورمالديهايد البروتينات بتسلسل الحمض النووي المرتبط عن طريق تكوين روابط تساهمية.

بعد ذلك ، استخدم عازلة تحلل مناسبة لتحلل الخلايا لإطلاق الكروماتين الذي يحتوي على مجمعات بروتين الحمض النووي المتشابكة. الطرد المركزي التعليق وصوتنة المادة الطافية للحصول على شظايا الكروماتين. بعد ذلك ، قم بتسمية العينة بجسم مضاد مناسب يرتبط على وجه التحديد بالبروتين المرتبط بالحمض النووي.

أضف حبات مغناطيسية متخصصة إلى العينة. تتعرف الخرزة على الجسم المضاد وترتبط به. استخدم مغناطيسا لجمع الخرزات المغناطيسية بمركب الجسم المضاد والبروتين والحمض النووي. اغسل العينة لإزالة الكروماتين أو الأجسام المضادة غير المرتبطة. أضف حاجزا عالي التركيز من الملح إلى المركب واحتضنه في درجات حرارة أعلى لعكس الروابط المتقاطعة لبروتين الحمض النووي.

باستخدام مغناطيس ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي والبروتينات. أضف إنزيم البروتيناز K لتحلل البروتينات في العينة. أضف حاجزا مناسبا لترسيب الحمض النووي واستخدمه لمزيد من التحليل. سيوضح البروتوكول التالي ترسيب الكروماتين المناعي في خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن لتحديد الجينات المستهدفة ل NFAT2.

- أولا ، قم بإعداد 20 ميكرولترا من حبات البروتين A المطلية لكل هطول في أنبوب واحد سعة 1.5 مل. اترك الخرزات تستقر على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة المادة الطافية. ثم اغسل الخرزات ب 40 ميكرولتر من 1x ChIP buffer 1 لكل 20 ميكرولتر من الخرز المطلي بالبروتين A عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

اترك الخرزات تستقر على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة المادة الطافية. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات أخرى قبل إعادة تعليق الخرزات بحجمها الأصلي البالغ 1x ChIP buffer 1. أضف BSA ، ومثبط الإنزيم البروتيني ، و 5x ChIP buffer ، والماء من الدرجة ChIP-seq إلى الخرز. بعد ذلك ، أضف الكروماتين المنفصم.

استخدم 10 ميكروغرام من الجسم المضاد ل NFAT2 لالتقاط NFAT2 و 2.5 ميكروغرام من الجسم المضاد IgG كعنصر تحكم. احتضان الخلطات طوال الليل عند 4 درجات مئوية على عجلة تدور بسرعة ستة دورات في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب لمدة خمس ثوان بمعدل 7,000 مرة جم واحتضانها على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية واغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام مخازن الغسيل 1 و 2 و 3 و 4 على التوالي. قم بتدوير الأنابيب لمدة خمس ثوان بمعدل 7,000 مرة جم قبل احتضان الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف مخزن الغسيل التالي.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتدوير الأنابيب لمدة خمس ثوان بمعدل 7,000 مرة جم ، احتضن الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية وتناول الخرزات في 100 ميكرولتر من محلول الشطف 1. ثم احتضان الأنابيب على العجلة الدوارة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة وضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 4 ميكرولتر من محلول الشطف 2. لإنشاء عنصر التحكم في الإدخال ، امزج 1 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم مع 99 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف واحد و 4 ميكرولتر من محلول الشطف الثاني. ثم احتضان العينات لمدة أربع ساعات عند 65 درجة مئوية مع الرج.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى الأنابيب. دوامة وتدوير العينات لمدة خمس ثوان عند 7,000 مرة جرام. ثم أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى كل عينة. دوامة واحتضان العينات على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة وضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازلة الأول. اقلب الأنابيب لخلطها واحتضانها لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب. ضعها في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة واستخدم ماصة لإزالة المادة الطافية.

ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني. اقلب الأنابيب للخلط ، واحتضانها لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة وضعها في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة مخزن الغسيل الثاني ، عن طريق الشفط ، وأعد تعليق الخرزات في 55 ميكرولتر من محلول الشطف.

لتصفية الحمض النووي المترسب ، احتضان العينات في عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة وضعها في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.