JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 5:21 د • April 30th, 2023
- يمكن للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم أو HSPC أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا الدم. تتراكم HSPCs تدريجيا طفرات الحمض النووي خلال العمر ، مما قد يساهم في الإصابة بسرطان الدم. لتحليل مثل هذه الطفرات ، يتم إنشاء HSPCs عادة من نخاع العظام.
ابدأ بإضافة الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور إلى الخلايا أحادية النواة - الخلايا الجذعية البالغة المعزولة من نخاع العظام - واحتضانها للمدة المطلوبة. ترتبط الأجسام المضادة بعلامات سطح خلية معينة مثل CD34. الآن ، قم بتحميل الخليط في القياس الخلوي المنشط بالفلورة أو آلة FACS.
تتألق الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور عند اصطدامها بالليزر. تمر قطرات الخلايا الفردية عبر الكاشف الذي يقيس شدة التألق ، والتي على أساسها تمتلك القطرة شحنة كهربائية. في وجود المجالات الكهرومغناطيسية ، تنتقل الخلايا الموجبة الشحنة إلى الحاوية السالبة والعكس صحيح.
الآن ، قم بزراعة HSPCs الإيجابية CD34 التي تم فرزها بواسطة FACS في وسط مناسب للمدة المطلوبة حتى تصبح المستنسخة مرئية. بعد ذلك ، قم بإزاحة المستنسخة عن طريق سحب العينات القوية والطرد المركزي لحبيبات الخلايا. قم بتخزين الحبيبات التي تحتوي على HSPCs نسيلة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التحليل. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإنشاء استنساخ HSPC من الخلايا أحادية النواة.
- ابدأ هذا الإجراء بإعداد عينة من المواد والتلوين كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإعداد 25 مل من الجذع المكونة للدم والخلية السلفية ، أو HSPC ، وسط الاستزراع. املأ لوحة زراعة الخلايا المكونة من 384 بئرا ب 75 ميكرولتر من وسط زراعة HSPC في كل بئر. لمنع تبخر الوسط في الآبار الخارجية ، املأ الآبار الخارجية ب 75 ميكرولترا من الماء المعقم أو PBS ولا تستخدم هذه الآبار لفرز الخلايا.
يعدالفرز الصحيح لإشارات HSPCs القابلة للتطبيق الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. قم بتعيين بوابات لفرز HSPC بناء على عنصر تحكم غير ملوث في 10,000 خلية من عينة البقعة. قم بتوصيل الخلايا المفردة عن طريق رسم بوابة حول ارتفاع التشتت الأمامي الخطي مقابل جزء منطقة التشتت الأمامي.
استخدم جزء التحكم غير الملوثة لرسم بوابة لجزء النسب. ارسم بوابات للخلايا الموجبة CD34 ، وقم بتمييز هذه المجموعة الفرعية بشكل أكبر عن طريق تعيين بوابة محددة للخلايا السالبة CD38 و CD45RA. قم بتحميل اللوحة 384 بئرا على جهاز FACS وفرز الخلايا المفردة. إذا كان ذلك ممكنا على جهاز FACS، فقم بالتبديل إلى خيار الاحتفاظ ببيانات فرز الفهرس لتمكين تتبع الخلايا التي تم فرزها.
لزراعة HSCs التي تم فرزها منفردة ، قم بلف لوحة الثقافة المكونة من 384 بئرا بغطاء في غلاف شفاف من البولي إيثيلين. انقل الصفيحة المكونة من 384 بئرا إلى حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون واحتفظ بها في الحاضنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع حتى تظهر المستنسخة المرئية. بعد أربعة أسابيع من الزراعة ، حدد الآبار التي يبلغ التقاء 30٪ أو أعلى.
لكل استنساخ ، قم بملء الأنابيب الدقيقة مقاس 1.5 ملم مسبقا ب 1 مليلتر من 1٪ BSA في PBS وقم بتسمية الأنبوب وفقا للبئر المقابل. قم بترطيب طرف الماصة مسبقا مع 1٪ من BSA في PBS لتقليل عدد الخلايا الملتصقة بطرف الماصة. قم بتقطيع الماصة بشدة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل أثناء كشط قاع البئر بماصة سعة 200 ميكرولتر مثبتة على 75 ميكرولترا.
اجمع تعليق الخلية في الأنبوب الدقيق المسمى الذي يتوافق مع البئر. كرر سحب العينات في البئر مع ما يصل إلى 75 ميكرولترا من BSA و PBS الطازجة بنسبة 1٪ لضمان أقصى امتصاص للخلايا. يمكن أن تلتصق الخلايا المزروعة نسليا بقاع البئر. افحص الآبار باستخدام مجهر ضوئي مقلوب قياسي للتأكد مما إذا كان قد تم جمع جميع الخلايا.
إذا تم حصاد جميع الآبار التي يزيد التقاء فيها عن 30٪ ، فضع اللوحة المكونة من 384 بئرا مرة أخرى في الحاضنة. يمكن أن تتكاثر الثقافات النسيلة لمدة تصل إلى خمسة أسابيع. قم بتدوير تعليق الخلية لمدة خمس دقائق عند 350 مرة جم. يجب أن تكون الحبيبات الصغيرة مرئية. قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية باستثناء حوالي خمسة ميكرولترات. يمكن تجميد كريات الخلايا عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر وتخزينها لعدة أشهر قبل عزل الحمض النووي.