فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا: طريقة لعزل الخلايا الإيجابية c-kit

- c-Kit ، أو CD117 ، هو مستقبل عبر الغشاء للتيروزين كيناز يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظام والدم. كما أنها علامة للكشف عن سرطان الدم النخاعي الحاد.

لعزل الخلايا الإيجابية c-Kit ، قم بحصاد عظام أرجل الفئران وسحقها لتحرير النخاع من الداخل. قم بتصفية معلق النخاع لإزالة أي شظايا عظمية. ضع طبقة من المرشح الذي يحتوي على خلايا نخاع العظم على وسط تدرج الكثافة ، وجهاز الطرد المركزي لفصل الخلايا أحادية النواة عن الكسور الأخرى.

اجمع الطبقة العكرة من الخلايا أحادية النواة في أنبوب يحتوي على حبات دقيقة مترافقة مع أجسام الفئران المضادة ل CD117. احتضان لمجمعات حبة الأجسام المضادة للارتباط بمستقبلات CD117 على الخلايا الإيجابية c-Kit. مرر التعليق المحتضن من خلال عمود مغناطيسي يوضع في مجال مغناطيسي. تظل جميع الخلايا الإيجابية c-Kit المسماة بالميكروبيدات المغناطيسية في العمود ، بينما تمر الخلايا غير المسماة.

قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي ، واغسل المحتويات باستخدام مخزن مؤقت مناسب لتصفية الخلايا الموجبة c-Kit. في البروتوكول التالي ، سنعرض عزل الخلايا الإيجابية c-Kit عن نخاع عظم الفأر المعدل وراثيا.

- للبدء ، احصد عظام الساق من فأر قتل رحيم. نظف الأنسجة من العظام بمشرط. ثم ضع العظام في PBS بارد على الجليد وسحق العظام بمدمقة. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب غطاء لولبي سعة 50 مليلتر بماصة سعة 10 ملليلتر. اغسل الهاون والمدقة عدة مرات باستخدام PBS البارد ، وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لنخاع العظم وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة الفراغ والزجاج. أعد تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من PBS. باستخدام ماصة ، أضف نخاع العظم المعلق ببطء إلى الجزء العلوي من عديد السكروز بدرجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتدوير عديد السكروز عند 400 جرام لمدة 20 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل. بعد الطرد ، اجمع واجهة الخلية أحادية النواة الكلية الغائمة باستخدام ماصة وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. ارفع الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS وقم بإزالة 20 ميكرولترا للعد.

بعد الطرد ، تخلص من المادة الطافية وضع الحبيبات على الثلج. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS باستخدام EDTA و BSA. أضف ميكروبيدات CD117 إلى تعليق الخلية والدوامة للخلط. بعد ذلك ، احتضان التعليق لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، ارفع الحجم إلى 10 ملليلتر مع المزيد من PBS مع EDTA و BSA وأجهزة الطرد المركزي عند 1,200 G عند 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

استخدم الفراغ لإزالة المادة الطافية وتعليق حبيبات الخلية في PBS مع EDTA و BSA. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من PBS مع EDTA و BSA إلى حامل مغناطيسي بعمود مغناطيسي واتركه يتدفق إلى أنبوب تجميع. بعد انتهاء المخزن المؤقت من التدفق عبر العمود ، أضف تعليق الخلية واتركه يتدفق عبر العمود إلى أنبوب التجميع.

بعد ذلك ، أضف 5 ملليلتر إضافي من PBS مع EDTA و BSA إلى العمود وقم بشطفه على الفور باستخدام المكبس. قم بإزالة المكبس وكرر التدفق قبل عد الخلايا. بعد الطرد المركزي للخلايا ، قم بإزالة المادة الطافية حبيبات الخلية في IMDM كامل للثقافة. استزراع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

• c-Kit (CD117) - A tyrosine kinase receptor expressed in hematopoietic stem cells.
• Acute Myeloid Leukemia – A cancer for which c-Kit serves as a marker.
• Mononuclear cells - A group of cells obtained after bone marrow fragmentation and filtration.
• Magnetic Microbeads - They are conjugated to anti-CD117 for cell separation.
• Magnetic Activated Cell Sorting - A method for isolating c-Kit positive cells.

• Introduce c-Kit - A receptor essential for hematopoietic stem cell growth (e.g., bone marrow cells).
• Key Concepts - Discuss the use of magnetic activated cell sorting (e.g., microbead induced separation).
• Underlying Mechanisms - Magnetic microbeads bind to c-Kit, allowing for cell isolation (e.g., sorting process).
• Connect to Experiment – The protocol showcases the isolation process from a transgenic mouse's bone marrow.

• What is c-Kit and how does it relate to hematopoietic stem cells?
• What is the role of magnetic activated cell sorting in isolating c-Kit positive cells?
• How does magnetic sorting establish c-Kit positive cell separation?

• Practical Applications – Isolating c-Kit cells contributes to leukemia research (e.g., marker confirmation).
• Industry Impact – The process aids in pharmaceutical and therapeutic developments (e.g., cancer therapy).
• Societal Importance – Improved patient diagnosis and treatment options (e.g., personalized medicine).
• Link to Scientific Advancements – Enhanced understanding of stem cell growth and function.