التنبيغ بوساطة الفيروسات القهقرية: طريقة لإدخال الجين المستهدف في الخلايا السرطانية

- الفيروسات القهقرية هي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تتكاثر باستخدام النسخ العكسي لتحويل جينوم الحمض النووي الريبي الخاص بها إلى حمض نووي مزدوج الشريطة والاندماج بشكل دائم في جينوم المضيف. تخرج الجزيئات الفيروسية الجديدة من الخلية ويمكن أن تصيب الخلايا الأخرى. يستخدم العلاج الجيني للسرطان نواقل الفيروسات القهقرية لإدخال الجينات العلاجية في الخلايا المستهدفة عبر تقنية تسمى التنبيغ لتقليل تنظيم الجين المتحور أو القضاء على الخلايا.

للحصول على نواقل الفيروسات القهقرية عالية العيار ، قم بنقل خلايا HEK 293 بخليط تعدي يحتوي على البلازميد الفيروسي القهقري المطلوب ، وبلازميد التعبئة ، وعامل نقل مناسب. احتضان الخلايا. يسهل عامل النقل توصيل كلا البلازميدات إلى الخلايا.

يقوم البلازميد الفيروسي القهقري بتشفير الجينوم الفيروسي بالجين المستهدف بينما يقوم بلازميد العبوة بتشفير بروتينات الغلاف الفيروسي. تشكل الآلات الخلوية لخلايا التعبئة جزيئات الفيروسية القهقرية وتطلقها في الوسط. اجمع المادة الطافية الفيروسية وأجهزة الطرد المركزي لإزالة الخلايا.

انقل التركيز المطلوب للجزيئات الفيروسية والخلايا السرطانية إلى صفيحة مزرعة مغلفة بالألياف الفيبرونيكتين لتسهيل ربط بروتينات الغلاف الفيروسي بالخلايا. احتضان الخلايا. اجمع الخلايا وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتحليل كفاءة التحويل. سيقوم هذا البروتوكول بإجراء نقل بوساطة الفيروسات القهقرية لخلايا نخاع عظم الفأر الإيجابية ل c-Kit.

- أولا ، اجمع بين الحمض النووي للبلازميد الفيروسي القهقري مع بلازميد العبوة وكلوريد الكالسيوم والماء في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 500 ميكرولتر من HBS إلى أنبوب آخر سعة 1.5 مل. أضف خليط التعدي بالتنقيط إلى الأنبوب الذي يحتوي على HBS مع الخلط في نفس الوقت مع ضبط الدوامة على أدنى إعداد.

احتضان خليط التعداء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة ، أضف الكلوروكين إلى خلايا HEK واحتفظ بها في الحاضنة. بعد إضافة مزيج التعداء ، احتضان الخلايا لمدة 8 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، وتغيير وسائط الخلية عن طريق إضافة 14 مل من وسائط DMEM 10 الطازجة ببطء شديد. يساعد التنقيط ببطء على جدار الطبق على منع أي تجريد من خلايا HEK.

ثم احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لجمع المادة الطافية الفيروسية. ثم قم بتوصيل مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر بالمحقنة. اغمر المادة الطافية الفيروسية في أنبوب تجميع جديد. اجمع المادة الطافية الفيروسية بعد 16 ساعة تقريبا.

بعد ذلك ، أضف 2 مل من جزء الفيبرونيكتين البشري المؤتلف في PBS إلى ألواح ثقافة 6 آبار غير معالجة. في اليوم التالي، استخدم ماصة لإزالة الفيبرونيكتين من الألواح. قم بسد الألواح بنسبة 2٪ BSA في PBS واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

استخدم مكنسة كهربائية لإزالة BSA وغسل الألواح باستخدام PBS قبل إزالتها بالمكنسة الكهربائية. بعد ذلك ، أضف على الفور المادة الطافية الفيروسية المفلترة وقم بالطرد المركزي للوحة لمدة ساعتين. استخدم مكنسة كهربائية لإزالة المادة الطافية وتدوير اللوحة مرة أخرى.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بفراغ وغسل الآبار المطلية بالفيروسات باستخدام PBS. قم بإزالة PBS بالمكنسة الكهربائية. أضف خلايا الفأر c-Kit + المزروعة مسبقا إلى الآبار المغلفة بالفيروسات. بعد الطرد المركزي ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة من التنبيغ ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في المخزن المؤقت رقم 1 ل FACS.