JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 3:31 د • April 30th, 2023
- في بعض الأحيان ، تخضع الخلية الجذعية أو السلفية لطفرات ، مما يؤدي إلى ظهور خلية جذعية سرطان الكريات. في هذه الخلايا ، يتم تنظيم بعض البروتينات ، ويمكن أن يساعد استخدام المركبات المضادة للسرطان ضد هذه البروتينات في التحكم في نمو الخلايا. يمكن تحليل تأثير هذه المركبات المضادة للسرطان باستخدام مقايسة CFU من خلال مراقبة عدد وحجم المستعمرات المتكونة.
ابدأ بأخذ الخلايا السلفية من فأر سرطان الدم وتخفيفها في وسط مزرعة مناسب. أضف معلق الخلية هذا مع المركب المناسب المضاد للسرطان إلى ميثيل السليلوز الذي يحتوي على السيتوكينات الخاصة بالفأر ، واسكبه في طبق بتري. احتضن هذا الخليط حتى تظهر المستعمرات. ميثيل السليلوز عبارة عن مصفوفة خاملة كيميائيا وشبه صلبة تمنع هجرة الخلايا بينما تحفز السيتوكينات الخلايا السلفية على التمايز وتشكيل مستعمرات تحتوي على ذرية يمكن التعرف عليها.
بعد ذلك ، قم بتلطيخ المستعمرات باستخدام كلوريد iodonitrotetrazolium ، أو INT ، واحتضانها طوال الليل حتى تتحول المستعمرات إلى اللون البني المحمر الداكن. تقلل إنزيمات الميتوكوندريا من INT ذات اللون الأصفر إلى صبغة فورمازان ذات اللون البني المحمر. أخيرا ، حدد عد المستعمرات الموجودة على اللوحة. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء اختبار CFU لاختبار تأثير المركبات المضادة للسرطان على الخلايا الإيجابية ل YFP.
- أولا ، قم بإذابة ميثيل السليلوز بالسيتوكينات للفئران في درجة حرارة الغرفة. ثم aliquot 3 ملليلتر من ميثيل السليلوز في أنبوب FACS. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع المثبطات المناسبة إلى 3 ملليلتر من ميثيل السليلوز. ثم قم بتدوير التعليق على ارتفاع لمدة 10 إلى 30 ثانية.
بعد هروب معظم فقاعات الهواء ، استخدم حقنة سعة 1 مليلتر للوحة 1 مليلتر من الوسائط في ثلاث لوحات مكررة. ضع الأطباق في طبق بتري كبير مع طبق مفتوح يحتوي على ماء معقم. ثم قم بتغطية طبق بتري الكبير ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
تحضير صبغة كلوريد iodonitrotetrazolium عن طريق إذابة 10 ملليغرام من كلوريد iodonitrotetrazolium في 10 مل من الماء. قم بتعقيم محلول التلوين باستخدام حقنة Luer-Lok المجهزة بفلتر 0.2 ميكرومتر.
في غطاء مزرعة الأنسجة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين بالتنقيط حول لوحة CFU. ثم احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا. أخيرا ، بعد أن تتحول المستعمرات إلى اللون الأحمر والبني الداكن ، استخدم خلفية بيضاء في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة لالتقاط صور للوحة CFU الملونة.