استقلاب البيورين خارج الخلية: اختبار قائم على HPLC لقياس توليد الأدينوزين والتمثيل الغذائي في خلايا سرطان الدم
موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 5:01 دقيقة • April 30th, 2023
- يساعد الأدينوزين ، وهو نيوكليوزيد بيورين موجود بتركيزات اسمية في الفضاء خارج الخلية ، على التحقق من تكاثر الخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية. خلال الحالات المرضية مثل سرطان الدم ، يزيد تركيز الأدينوزين خارج الخلية ويمنع الاستجابات المناعية ضد الخلايا السرطانية. ينتج تراكم الأدينوزين إما عن إزالة الفسفرة من نوكليوتيدات ATP أو ADP ، أو بسبب ضعف تحلل الأدينوزين إلى نيوكليوزيد الإينوزين.
لقياس توليد الأدينوزين واستهلاكه ، قم بزراعة الخلايا السرطانية في وجود ركيزة نيوكليوتيدات. يحدد النشاط الأيضي للأدينوزين للخلايا تركيزات جزيئات البيورين المختلفة الموجودة داخل المزرعة. جهاز طرد مركزي لإزالة الخلايا والحصول على جزيئات البيورين في المادة الطافية.
لفصل البيورينات وتحديدها كميا ، انقل العينة إلى قوارير مناسبة. قم بتحميلها في مرحلة معكوسة ، أو كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو عمود RP-HPLC ، يحتوي على طور ثابت ثابت مشدود بروابط كارهة للماء. أثناء المرور عبر العمود ، تمتص الجزيئات الكارهة للماء إلى الروابط ويتم الاحتفاظ بها بناء على كرهها للماء. تتدفق الجزيئات الأقل كارهة للماء أولا ، بينما تتخلص التحليلات الكارهة للماء في النهاية.
تساعددراسة خاصية الذروة لكل مادة تحليلية في مخطط كروماتوغرام HPLC في تحديد تركيزاتها داخل العينة. في هذا البروتوكول ، نستخدم تقنية RP-HPLC لتحديد استقلاب الب
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية