Name: المفرد جزيء التصوير النقل النووية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: تعلم تصوير الجزيئات الفردية لدراسة النقل النووي عبر المجمعات النووية باستخدام مجهر الفلورة. يتيح هذا الأسلوب تحليل ديناميكيات النقل بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد أيد هذا المشروع من المنحة لتعزيز القدرات البحثية (جامعة بولينغ غرين ستيت).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يجب توخي الحذر لضمان اقامة colocalization السليم للجزيئات واحد NE أثناء التجربة. من المهم أيضا أن تقدم إشارة ارتفاع نسبة الضوضاء ، وخصوصا عندما إشارة منخفضة نظرا لوضع العلامات أو photobleaching الفقراء. يقتصر دقة الترجمة عن الضوضاء الخلفية (التي تنشأ من خارج التركيز مضان ، CCD الضوضاء قراءات العوامل الظلام ، والحالية وغيرها).

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

وقد ثبت جدوى النهج جزيء المجهري مضان واحد لتكون ذات جدوى كبيرة في فهم التفاعلات البيولوجية على مدى العقد الماضي. وظل التحقيق في التفاعلات الجزيئية مع ارتفاع قرارات الزمانية والمكانية عميقة داخل الخلايا صعبة بسبب إشارات ضعيفة بطبيعتها الناشئة من الجزيئات الفردية. يعمل يانغ مؤخرا وآخرون. أثبتت أن ضيق المجال المجهري epifluorescence التصور يسمح للنقل النواة للهيولى على مستوى الجزيء واحد. من النهج جزيء واحد ، حركية مهمة ، مثل النقل النووي الوقت والكفاءة ، لجزيئات البضائع التي تعتمد على إشارة ومستقلة قد تم الحصول عليها. وصف نحن هنا بروتوكولا للنهج المنهجي مع القرار ، أي spatiotemporal تحسين نانومتر و 12 مللي 0.4. مكن قرار تحسين لنا لالتقاط النقل النشط والأحداث العابرة نشر السلبي من خلال مسام المجمعات النووية (مجلس الشعب) في شبه سليمة الخلايا. نتوقع أن يستخدم هذا الأسلوب في توضيح الأحداث الأخرى ملزمة والاتجار داخل الخلايا.

approch قدم واحدة جزيء المجهري رؤى الرواية إلى النقل النووي.

ثبتت فائدة مناهج مجهر الفلورسنت للجزيء المنفرد في تقديم مساعدة كبيرة في فهم التفاعلات البيولوجية على مدى...

يحتوي الغلاف النووي للخلية على ما يقرب من 2000 معقد من المسام النووية التي تسمح بنقل الجزيئات القابلة للذوبان في الماء مثل RNA، والريبوسومات، وبروتينات معينة، والكربوهيدرات، والجزيئات الإشارية. ومن خلال إضافة جزيئات شحنة مُعلمة إلى الخلايا النفاذة، يمكن تصور حركة الجزيئات الفردية عبر المسام النووية باستخدام المجهر الفلوري. وتُعد الصور المتقطعة بفاصل زمني (Time-lapse) ضرورية لتحديد التموضع بالإضافة إلى الخصائص المكانية والزمانية مثل وقت النقل، وكفاءة الاستيراد والتصدير، وتكرار الدخول. مرحباً، أنا أليكس أوف، طالب دكتوراه من مختبر مجهر الجزيء الواحد في قسم الأحياء بجامعة بولينج جرين الحكومية.أنا آشا بي شيما، طالبة ماجستير من مختبر مجهر الجزيء الواحد. وأنا جمعة، زميلة ما بعد الدكتوراه هنا في مختبر مجهر الجزيء الواحد.سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الجزيئي الفردي للنقل النووي عبر معقدات المسام النووية في خلايا HeLa. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة انتقال الجزيئات المختلفة عبر معقد المسام النووي. لذا، لنبدأ.لتحضير البروتينات الخاصة بتجربة النقل النووي، يتم تحويل بكتيريا E coli من سلالة JM 1 0 9 التي تعبر عن الجينات المسؤولة عن إنتاج بروتينات الشحنة النووية تقليدياً، وتُزرع في وسط LB ثم تُحفز باستخدام IPTG. وبمجرد وصول الخلايا إلى طور النمو اللوغاريتمي بكثافة ضوئية تتراوح بين 0.7 و 0.8، يتم طرد المزرعة مركزياً عند 6,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم يتم التخلص من الراشح ووزن الراسب. بعد ذلك، تُعاد معالقة الخلايا في 10 milliliters من محلول Celtic B لكل جرام لاستخلاص البروتين المناسب للتنقية بالألفة والتحليل.بعد ذلك، أضف الكمية المناسبة من مزيج البروتياز (protease cocktail) في midsole DNAs one و beta me capto ethanol. حرّك الخليط في الظلام على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 25,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.بعد عملية الطرد المركزي، انقل الطافي إلى زجاجة جديدة تمهيداً لعملية الكروماتوغرافيا. ضع 400 µL من nickel NTA والأسيتون في أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة. قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g لمدة ثلاث دقائق.تخلص من السائل الطافي. ثم أضف 400 µL من محلول غسيل التحلل. كرر خطوات الغسيل السابقة ثلاث مرات بعد عملية الغسيل النهائية.أعد تعليق nickel NTA في محلول التحلل (lysis buffer) وأضف الأنابيب الأربعة جميعها إلى الزجاجة التي تحتوي على الرائق الخلوي (cell supinate). حرك المزيج الناتج ببطء في حاوية معتمة فوق الثلج لمدة 60 دقيقة أثناء عملية التقليب. قم بتجهيز عمود كروماتوغرافيا ecno pack عن طريق لفه بورق القصدير لمنع التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية.ضع أيضاً 12 أنبوب تجميع في حامل أسفل العمود. بمجرد تقليب الخليط لمدة 60 دقيقة، قم بتحميل 10 milliliters من خليط SNA nickel NTA واتركه يمر بالكامل. ابدأ في جمع الكسور.بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول غسيل التحلل (lysis wash buffer)، واتركه يمر بالكامل. ثم أضف 10 milliliters من محلول IZO buffer واتركه يمر.استمر في جمع الكسور. بعد ذلك، مرر 0.5 milliliters من محلول الاستخلاص واتركه يتدفق، وكرر تمرير محلول الاستخلاص حتى يتم جمع كافة الكسور الـ 12. ولتحديد الكسر الذي يعطي أعلى تركيز من البروتين، قم بتشغيل 4 µL من كل كسر على هلام PAGE ثم استخدم صبغة Coomassie.وفقاً للإجراءات القياسية، اجمع الكسور الأكثر تركيزاً وأضف 500 µL إلى مرشح nano step بحجم مسام 10 kDa تم شطفه مسبقاً بمحلول elution buffer. ركز البروتين عن طريق الدوران بسرعة 16,000 ×g لمدة خمس دقائق. تخلص من المحلول المنظم، وحرك كسر البروتين المتبقي ثم أضف 500 µL أخرى إلى جهاز الطرد المركزي المرشح.كرر العملية مرة أخرى لجميع الأجزاء المختارة. بعد ذلك، قم بتكملة الحجم النهائي للبروتين المركز ليصل إلى حوالي 50 microliters باستخدام محلول الاستخلاص المنظم (elucian buffer). ثم، أثناء التقليب برفق باستخدام ماصة دقيقة من سطح المرشح، استمر في تمرير العينة عبر أعمدة التبادل الأيوني والاستبعاد الحجمي للحصول على بروتين فائق النقاء، ثم حدد التركيز النهائي للبروتين.بعد ذلك، قم بوسم جزيئات الشحنة بصبغة عضوية تفاعلية مساعدة فائضة مثل Alexa 555 أو Alexa 647. يتم ذلك لأن الفلورة الخضراء الجوهرية لبروتين GFP لا يمكن استخدامها في تصوير الجزيء الواحد للنقل النووي بسبب ضعف استقرارها الضوئي وتداخل طيفها مع الفلورة الذاتية للخلية. يجب تقسيم البروتين الموُسّم إلى عدة أجزاء بحجم 25 µL وتخزينها عند درجة حرارة -80 °C قبل يوم واحد من إجراء التجارب. ضع غطاء شريحة زجاجية معقمة بجهاز الأوتوكلاف في طبق بتري معقم بقطر 35 mm، ثم انقل إليه 9 mL من وسط DMEM باستخدام الماصة.بعد ذلك، استخدم الماصة لسحب 1 mL من المزرعة الخلوية ووضعها بشكل متساوٍ على شريحة الغطاء. كانت الخلايا المستخدمة هنا معدلة وراثياً مسبقاً للتعبير عن بروتين غشائي مسامي مُسمى POM 1 21 وموسوم بـ GFP. ضع الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة.في يوم التجربة، ابدأ بتحضير غرف التدفق. بعد ذلك، استخرج الشريحة المطلية بالخلايا من الحاضنة بعناية، وجفف الشريحة، ثم ثبتها باستخدام غراء التشحيم المفرغ من الهواء. في إطار من الألومنيوم مصنع آلياً، من الضروري التأكد من عدم جفاف الخلايا أثناء عملية التحضير.باستخدام حقنة بلاستيكية سعة 10 milliliter، قم بوضع خطين من السيليكون على كلا جانبي غطاء الشريحة باستخدام الملقط. ارفع غطاء الشريحة الصغير المُجهز الذي طُبقت عليه خطا السيليكون وضعه مقلوباً فوق الشريحة المطلية بالخلايا، ثم اضغط لأسفل بخفة لتشكيل غرفة التدفق. في حال تجهيز غرفتين منفصلتين على شريحة واحدة مطلية بالخلايا، فمن الضروري ضمان إحكام الغلق لمنع التلوث الخلطي.قم بوضع عدة خطوط من الشحم السيليكوني بين الغرف من أعلى الشريحة إلى أسفلها لعزلهما عن بعضهما البعض. كما يجب وضع عدة خطوط من الشحم على الجوانب الخارجية للغرف. أضف DMEM إلى غرفة التدفق لمنع جفاف الخلايا.بعد ذلك، وباستخدام مسحة قطنية، اغسل الجزء السفلي من الشريحة مرتين بالماء ثم مرتين بـ 100% ethanol. ثبت الإطار على المجهر. اغسل الشريحة مرتين باستخدام 25 µL من محلول النقل المنظم (transport buffer) عن طريق إضافته إلى غرفة التدفق ثم سحبه بالامتصاص.باستخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح توضع عند جانب المخرج، قم بنفاذ الخلايا مرة واحدة لمدة دقيقتين تقريبًا باستخدام 25 µL من digitonin، ويجب مراقبة عملية النفاذ في الوقت الفعلي باستخدام المجهر ذو المجال الساطع (brightfield). وأخيرًا، اغسل الخلايا باستخدام 25 µL من محلول النقل المنظم (transport buffer)، المضاف إليه 1.5% polyvinyl pyro أو PVP لمنع التورم الاسموزي للنوى. حدد موقع الخلايا المنفذة تحت المجهر وابحث عن حلقة فلورية خضراء ساطعة.بعد ذلك، ركز على خط استواء الخلية والتقط صورة قبل إضافة جزيئات الشحنة الفلورية. قم بإزالة أي تألق ذاتي عن طريق تحديد منطقة الغلاف النووي والإضاءة باستخدام ليزر الهيليوم-نيون بطول موجي 633 nanometer حتى يتم تبييضها ضوئياً بالكامل. عادة ما يتطلب الأمر أكثر من دقيقتين.أضف عينة الدكستران المحددة والمخففة في محلول النقل المنظم الذي يحتوي على 1.5%PVP إلى غرفة التدفق بحجم 25 microliters، ومررها عبر الغرفة باستخدام فتيلة من ورق الترشيح. يجب توخي الحذر عند إضافة بروتينات الشحنة المستوردة، وهي الخلايا النفاذة، حيث يمكن أن يختل التركيز بسهولة نتيجة أي حركة قوية. قم بتشغيل القاطع الضوئي بتردد خمس hertz تقريبًا لتجنب التبييض الضوئي وللسماح لجزء جديد من الجزيئات المنفردة غير المبيضة ضوئيًا بالاقتراب من الغلاف النووي.يجب الحصول على سلسلة من مقاطع الفيديو لعملية انتقال الجزيء الواحد بمجرد إضافة الجزيئات العينة، بحيث يمكن رصد الانتقال عبر المعقدات المسامية النووية. استخدم ليزر الهيليوم نيون بطول موجي 633 nanometer لإضاءة مسارات نقل الجزيئات المنتقلة في حال تم الإجراء بشكل صحيح. يتيح هذا البروتوكول جمع سلسلة من الصور التي توضح انتقال جزيئات شحن مفردة تتفاعل مع المعقد المسامي النووي.في المسام، تظهر الخلايا من 1 إلى 21. ومن خلال تتبع المسارات المكانية لجزيئات الدكستران المنفردة العابرة، يمكن تمييز الخطوات الدقيقة للانتشار عبر الغلاف النووي. يظهر هنا حدث انتقال من السيتوبلازم إلى النواة، حيث بدأت جزيئة دكستران واحدة (موضحة كنقطة حمراء) من السيتوبلازم، وتفاعلت مع الغلاف النووي (الموضح كخط بكسلي أخضر)، وانتهت هنا في النواة.بدأ جزيء الديكستران من السيتوبلازم، ثم تفاعل مع الغلاف النووي وعاد مرة أخرى إلى السيتوبلازم. وفي هذا المثال، بدأ جزيء الديكستران من النواة، ثم تفاعل مع الغلاف النووي وعاد مرة أخرى إلى النواة. وهنا بدأ جزيء الديكستران من النواة، ثم تفاعل مع الغلاف النووي وانتهى به المطاف في السيتوبلازم.من خلال تتبع المسارات المكانية لجزيئات الديكستران المنفردة المفلورة، يمكن تمييز الخطوات الدقيقة للانتشار عبر الغلاف النووي. تم تحديد مسارات الحدث الموضحة بخطوط زرقاء ونقاط مفتوحة، وتم دمجها مع الغلاف النووي الموضح بخط أسود. تمثل الخطوط الخضراء والحمراء مسافة 100 nanometer من الغلاف النووي على جانبي السيتوبلازم والنواة.لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصور انتقال الجزيئات المفردة عبر معقد الثقب النووي بدقة تبلغ 10 nanometer وبفاصل زمني قدره 400 microseconds. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة تحقيق أقصى نسبة ممكنة للإشارة إلى الضوضاء، وكذلك توخي الحذر الشديد عند إجراء تجربة الجزيء المفرد لأن التركيز البؤري يمكن أن يختل بسهولة. وهذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف الأدوات والأساليب للكشف عن جزيئات البروتين وحيد fluorescently المسمى-التفاعل مع جزيء DNA واحدة معلقة بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

يصف لنا إجراء للكشف عن هذا الموقع في العناصر الكيميائية في الخلايا البشرية، فضلا عن تقديرها في المختبر . الطريقة مناسبة تماما لأي نوع من الخلايا ومفيد بشكل خاص للتحاليل الكيميائية الكمية في الخلايا المفردة التالية في المختبر أكسيد المعدن جسيمات نانوية التعرض.

في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

ويصف هذا البروتوكول أسلوب جديد يسمح للتصور الكمي من تشكيل معقدة من البروتينات الفخ، استناداً إلى نقل الطاقة الرنين فورستر، وعمر fluorescence التصوير المجهري.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

هنا توضح لنا كيف جزيء واحد التعريب تنشيط صور مجهرية يمكن الاضطلاع على المحطة الطرفية الأعصاب الحركية ليعيش melanogaster المورفولوجية الثالثة instar اليرقة.

في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد

نحن نصف أساليب التفكيك الضوئي الفلورية لتحليل النقل المحوري للاعصاب في محاور عصبية واحدة من الأعصاب النخاعية من الفئران المحورة وراثيا التي تعبر عن بروتين الليفية العصبية تنشيطية ضوئية.

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد وإجراء التحليلات الآلية بكفاءة لبيانات تصوير الخلايا الحية التي تم الحصول عليها من تتبع النقل النووي للخلايا عبر أدوات البصريات الوراثية.

استخدام أدوات علم الوراثة البصرية LEXY و LINuS وتحليل الصور الآلي لتحديد ديناميكيات النقل النووي للسيتوبلازمات في الخلايا الحية

يقدم هذا البروتوكول سير عمل فعال لتصوير المجهر لتحديد موقع جزيء واحد لنوى الأرابيدوبسيس المعزولة، باستخدام العزل والتثبيت ووضع العلامات المحسنة لتحقيق تصور موثوق على نطاق نانوي للكروماتين وبوليميراز RNA II. يمكن تكييف هذا النهج بسهولة مع بروتينات أخرى مرتبطة بالكروماتين أو تعديلات الهيستونات للتصوير عالي الدقة.

بروتوكول مبسط لمجهر تحديد موقع جزيء واحد في نوى الأرابيدوبسيس

وينظم الغشاء ظيفة البروتين الدهني من تكوين غشاء الخلية. تفاصيل هذا الفيديو المقالة كيفية تشكيل التصحيح باستخدام طبقة ثنائية الأقطاب التصحيح ، فضلا عن كيفية استخدام القنوات غراميسيدين وصحفيين من خصائص الغشاء تغييرها.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

تعلم تصوير الجزيئات الفردية لدراسة النقل النووي عبر المجمعات النووية باستخدام مجهر الفلورة. يتيح هذا الأسلوب تحليل ديناميكيات النقل بدقة عالية.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

استكشف المزيد من الفيديوهات