تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

في المرضى البالغين المصابين بفيروس HIV، يتداخل الالتهاب العصبي مع الإشارات التشابكية الطبيعية، مما يؤدي إلى قصور في الوظائف الإدراكية العصبية، بما في ذلك صعوبات في التجريد، والطلاقة اللفظية، والانتباه والتعلم، واستيعاب المعلومات الجديدة والذاكرة. يحفز البروتين tat الخاص بفيروس HIV-1 إفراز جزيئات التهابية، والتي يمكن أن تحاكي الخلل الوظيفي التشابكي الملاحظ لدى مرضى HIV. تُستخدم هنا فئران بالغة تعبر عن GFP في الخلايا أحادية النواة، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة، لدراسة الالتهاب العصبي الناجم عن HIV-1 tat باستخدام مجهر الفوتونين عبر الجمجمة الرقيقة.

يمكن تصوير استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة بعد حقن tat داخل الجسم الحي. وتظهر الصور الناتجة تقصيراً وتسمكاً في استطالات الخلايا الدبقية الصغيرة وتكوّن تراكيب تشبه الكؤوس البالعة، بالإضافة إلى انتقال الخلايا الوحيدة الطرفية في الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. مرحباً، أنا دان ماركر من مختبر هيريس جالبارد ومركز التطور والأمراض العصبية في جامعة روتشستر.

مرحباً، أنا EF Trombley من مختبر Esca في قسم البيولوجيا العصبية والتشريح بجامعة روتشستر. ومرحباً، أنا Shain Luu، أيضاً من مختبر Albas. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير ثنائي الفوتون باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة الالتهاب العصبي المزمن. لذا، لنبدأ في التجربة الموضحة هنا، حيث تُستخدم الفئران التي تعبر عن GFP في سلالات الخلايا أحادية النواة، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة.

يمكن استخدام سلالات مختلفة من الفئران لتلبية احتياجات مشروع معين. ابدأ في تحضير فأر مخدر باستخدام الفنتانيل والميدازولام من أجل الجراحة. أولاً، تأكد من أن الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة مثل قرصة الذيل.

ضع الحيوان على وسادة تدفئة لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم بعد التخدير. ثم غطِّ عيني الحيوان بمرهم عيني واقٍ للحفاظ على رطوبتهما. يجب أن تكون جميع الأدوات الجراحية قد خضعت للتعقيم بجهاز الأوتوكلاف أو باستخدام معقم الخرز الزجاجي، ثم قم بتطهير الأدوات بشكل إضافي عن طريق غمرها في ethanol 70%.

باستخدام مقص، قم بإزالة الشعر من فروة رأس الحيوان، ثم عقم المنطقة باستخدام محلول بوفيدون يود بتركيز 10% وإيثانول بتركيز 70%. ابدأ الجراحة باستخدام مقص صغير لإجراء شق خطي في منتصف فروة الرأس، بدءاً من مسافة أربعة إلى خمسة مليمترات خلف الجمجمة والتقدم للأمام وصولاً إلى مقدمة العينين. يجب أن يكون هذا الشق طويلاً بما يكفي لضمان عدم تداخل الجلد مع عملية لصق الصفيحة التي تثبت رأس الفأر أثناء التصوير ثنائي الفوتون.

بعد ذلك، ضع 100%ethanol باستخدام مسحة قطنية معقمة لتجفيف الأغشية الموجودة فوق الجمجمة. قم بكشطها وإزالتها باستخدام ملاقط دقيقة. إذا لم يتم إزالة الأغشية، سيكون تثبيت صفيحة الرأس غير مستقر.

باستخدام مجهر تشريحي، حدد المنطقة المراد ترقيقها. تجنب المناطق ذات الأهمية التي تقع مباشرة فوق الغرز القحفية، حيث تكون الجمجمة أقل استقراراً في هذه المناطق، كما أن الأوعية الدموية الكبيرة والسحايا الموجودة تحتها ستتداخل مع التصوير المرسل إلى نافذة العرض في المنطقة المستهدفة. بعد ذلك، وباستخدام مسحة قطنية، حاول معالجة الجمجمة مرة أخرى باستخدام محلول كلوريد الحديديك بتركيز 10%.

ضع طبقة رقيقة من غراء perma bond, nine 10 حول حواف نافذة المعاينة أسفل اللوحة الرأسية. ثم ضع اللوحة فوق المنطقة المستهدفة في جمجمة الحيوان مع تطبيق ضغط خفيف لربط الغراء. ضع كمية صغيرة من الأكريليك حول حافة نافذة المعاينة باستخدام حقنة.

أخيراً، ضع كمية صغيرة من Tite 4 54 على حواف نافذة الرؤية لمنع التسرب. قم بتثبيت صفيحة الرأس في حامل الحيوان وبالتدقيق في الثبات باستخدام مجهر تشريحي؛ فمن خلال الفحص الخفيف باستخدام ملقط، يجب ألا تكون هناك أي حركة للجمجمة بالنسبة لصفيحة الرأس.

ضع قطرة من المحلول الملحي على نافذة الرؤية للتأكد من عدم وجود تسريبات استعداداً لعملية الترقيق. جفف الجمجمة باستخدام مزيج من مسحات القطن المعقمة والهواء المضغوط. قم بترقيق الجمجمة باستخدام ريشة مثقاب IRF 0 0 7 في مثقاب دقيق (micro to two drill).

عند 4,000 RPM. ابدأ برفق شديد في ترقيق منطقة دائرية بقطر يتراوح من 2 إلى 2.5 مليمتر. استخدم فقط حركات مسح خفيفة تكون موازية تقريبًا للجمجمة.

تجنب استخدام الضغط المباشر لأسفل. توقف عن الحفر كل 20 إلى 30 ثانية لإزالة غبار العظام باستخدام الهواء المضغوط. تسمح فترات التوقف هذه عن الحفر بتبريد الجمجمة لتجنب حدوث تلف ناتج عن الحرارة في أنسجة الدماغ الكامنة.

مع تقدم عملية الحفر، لاحظ الانتقال إلى طبقة العظم الشوكي الأكثر رطوبة والتي تسمى Diplo. وبمجرد الوصول إلى هذه الطبقة، توخَّ حذراً إضافياً عند استخدام المثقاب. تحقق من حين لآخر من مدى رقة الجمجمة عن طريق وضع محلول ملحي فوق المنطقة الرقيقة ومعاينتها تحت مجهر التشريح.

سيعمل المحلول الملحي بشكل إضافي على تشتيت الحرارة. ومع ترقيق الجمجمة، تصبح الأوعية الدموية الأصغر مرئية. استخدم شفرة سنية دقيقة لإتمام عملية الترقيق النهائية تحت المحلول الملحي.

توفر الشفرة الدقيقة (microblade) تغذية راجعة لمسية أكبر بكثير حول استقرار الجمجمة. وهذا يسمح بإجراء تحضيرات أكثر رقة بكثير مما هو ممكن باستخدام المثقاب وحده. يتراوح سمك الجمجمة الأمثل للتصوير بين 10 و 30 micrometers.

تستغرق عملية الترقيق بأكملها عادةً ما بين 15 و30 دقيقة. تحقق من درجة ترقيق الجمجمة تحت الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence) عدة مرات أثناء إنشاء نافذة الجمجمة الرقيقة. تمنح حدة وعمق الخلايا الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية المرئية مؤشراً جيداً على الوقت الذي تصبح فيه النافذة جاهزة للتصوير.

بمجرد أن تصبح النافذة جاهزة، استخدم ماصة زجاجية بقطر 1 مليمتر لوضع قطرة صغيرة من غراء Cy acrylic على منطقة الجمجمة الرقيقة، ثم أنزل قطعة من غطاء الشريحة (cover glass) فوقها بعناية. بعد ذلك، اضغط برفق على الجمجمة لإخراج أي غراء زائد، مع تجنب تكون فقاعات بين الجمجمة وغطاء الشريحة، حيث قد تعيق الرؤية. وبمجرد جفافه، استخدم شفرة مجهرية لإزالة أي غراء متبقٍ على سطح غطاء الشريحة بعناية تمهيداً للتصوير ثنائي الفوتون.

قم بتغطية نافذة القشرة الجمجمية الرقيقة بالمحلول الملحي وحدد المنطقة المستهدفة تحت الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence). ولتمكين التصوير اللاحق للمنطقة، التقط صورة باستخدام كاميرا تصوير مخصصة للتصوير. يظهر هنا استخدام مجهر فوتوني مخصص ثنائي الفوتون مع ليزر تيتانيوم ياقوتي (ti sapphire laser) مضبوط على 920 نانومتر.

يتم الكشف عن الفلورة باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي أو PMT في وضع الكشف عن المجال الكامل ومرشح انبعاث 5 81 80. تُستخدم عدسة غمر مائية 20x طوال جلسة التصوير. يتم ضبط الحد الأقصى لخرج قدرة الليزر للعدسية بين 50 و 65 milliwatts.

بعد ذلك، حدد منطقة الاهتمام، سواء كانت الطبقة القشرية الأولى أو الثانية، وصولاً إلى 150 ميكرومتر تحت سطح القشرة. ولتسهيل إعادة التصوير، التقط صوراً لنفس مجال الرؤية عند تكبير رقمي 1x و2x و3x. يمكن أن تعمل الأوعية الدموية كعلامات مميزة للعثور بسهولة على نفس مجال الرؤية خلال جلسات التصوير اللاحقة.

عند تكبير بمقدار three x، يتم الحصول على عدة Zacks بمعدل 80 إلى 90 من خطوات Z لكل منها، وبخطوة قدرها 0.69 micrometer كل خمس دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة. يتيح ذلك أخذ عينات جيدة من مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة وسلوكها بمرور الوقت بين عمليات الحصول على Zacks، كما يتم التحقق من مستوى المحلول الملحي وعمق التخدير. وإذا لزم الأمر، يمكن إعطاء جرعة تعزيزية تعادل one third من الجرعة الأصلية من خليط التخدير أثناء الإجراء لمنع ترسب tat على المحقنة والإبرة أثناء أيام الحقن قبل الحقن.

قم بمعالجة السطح الداخلي لإبرة مقاس 35 ومحقنة دقيقة سعة 10 µL بمادة السيليلوز عن طريق سحب محلول القياس حتى يملأ كلًا من الإبرة والمحقنة. اترك المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتفريغ المحلول من المحقنة، وأزل المكبس واترك المحقنة والإبرة لتجفا تمامًا. وأخيرًا، اغسل المحقنة والإبرة جيدًا بالماء منزوع الأيونات.

بمجرد إجراء عملية السيلنة، يمكن استخدام المحقنة والإبرة لأكثر من ستة أشهر قبل أن يصبح من الضروري إعادة الترميز. في يوم الحقن، ضع قطرة صغيرة من محلول TAT على شريحة زجاجية مسيلنة. وباستخدام طرف ماصة مسيلن، اسحب الكمية المطلوبة من المحلول إلى محقنة الأحجام الدقيقة من هذه القطرة.

باستخدام ريشة مثقاب، قم بإجراء ثقب صغير في الجمجمة بقطر 0.5 مليمتر، على مسافة ثلاثة مليمترات إما في الاتجاه الأنفي أو الجانبي بالنسبة لنافذة القشرة الرقيقة في الجمجمة التي تم الحصول منها على صور الفوتونين. ولتحقيق ذلك، قم بترقيق الجمجمة بعناية، ثم استخدم ملقطاً حاداً لإزالة طبقة العظم الرقيقة.

استخدم الملاعب الدقيق لمحاذاة الإبرة مقاس 35 والمحقنة مع فتحة الجمجمة. ثم قم بدفع الإبرة بعناية إلى عمق يتراوح بين 700 إلى 900 micrometers أسفل سطح التقشير. يتم حقن 3 µL بمعدل 80 nL في الدقيقة باستخدام مضخة محقنة يتم التحكم فيها بواسطة معالج دقيق.

يوضح هذا الشكل الخلايا الدبقية الصغيرة المسمى ببروتين GFP والتي تم تصويرها باستخدام التصوير ثنائي الفوتون بعد زرع نافذة القشرة الدماغية ذات الجمجمة الرقيقة، على عمق 50 micrometers تقريباً تحت سطح القشرة. وتُظهر المقاطع ثنائية الفوتون المنفردة التي تم التقاطها في اليوم صفر، بعد 15 إلى 30 دقيقة من زرع نافذة القشرة الدماغية ذات الجمجمة الرقيقة، بالإضافة إلى المقاطع التي التُقطت بعد سبعة و17 يوماً، أن النوافذ تظل صافية بينما تظل الخلايا الدبقية الصغيرة نشطة في غياب المثيرات الالتهابية. وهذا يسلط الضوء على فائدة هذه الطريقة في استقصاء التفاعلات الطبيعية والالتهابية بين الخلايا المناعية المؤثرة وأنواع الخلايا العصبية الأخرى.

تُظهر مساقط المحور Z (Z projections) التي تم التقاطها بعد 6 و24 ساعة من حقن سم HIV العصبي TAT داخل الجسم (In vivo) تغيرات مورفولوجية واضحة في الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة. وهو ما يثبت بشكل أكبر قدرتنا على دراسة التغيرات المورفولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي في النماذج الحادة والمزمنة للالتهاب العصبي. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير نافذة جمجمة رقيقة واستخدامها لدراسة الالتهاب العصبي عند إجراء هذا الإجراء.

من المهم تذكر التمهل عند التعامل مع الجمجمة لمنع حدوث أي تلف ناتج عن عملية التحضير نفسها. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.