تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم حيدات

في المرضى البالغين المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ، يتداخل الالتهاب العصبي مع الإشارات المشبكية الطبيعية مما يؤدي إلى عجز عصبي معرفي يشمل صعوبات في التجريد والطلاقة اللفظية وتعلم الانتباه والمعلومات الجديدة والذاكرة. يؤدي فيروس نقص المناعة البشرية إلى إفراز الجزيئات الالتهابية ، والتي يمكن أن تحاكي الخلل الوظيفي المشبكي الذي يظهر في مرضى فيروس نقص المناعة البشرية هنا. تستخدم الفئران البالغة التي تعبر عن GFP في الخلايا أحادية النواة ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، للتحقيق في التهاب الأعصاب الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الفحص المجهري للجمجمة الرقيقة ثنائية الفوتون.

يمكن تصوير استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة بعد حقن تات في الجسم الحي. توضح الصور الناتجة تقصير وسماكة العمليات الدبقية الدقيقة وتشكيل هياكل تشبه الكأس البلعمية بالإضافة إلى تهريب الخلايا الوحيدة المحيطية في الأوعية الدماغية الدقيقة. مرحبا ، أنا دان ماركر من مختبر هاريس جالبارد ومركز التطور العصبي والأمراض في جامعة روتشستر.

مرحبا ، أنا EF Trombley من مختبر Esca في قسم علم الأعصاب والتشريح في جامعة روتشستر. مرحبا ، أنا شين لو ، أيضا من مختبر ألباس. سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير فوتونين باستخدام مستحضر جمجمة رفيع.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة الالتهاب العصبي المزمن. لذلك دعونا نبدأ في التجربة الموضحة هنا. يتم استخدام OT express GFP في سلالات الخلايا أحادية النواة بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة.

يمكن استخدام سلالات مختلفة من الفئران لتلبية احتياجات مشروع معين. ابدأ في تحضير فأر مخدر من الفنتانيل وميدازولام مين للجراحة. أولا ، تأكد من أن لم يعد يستجيب للمنبهات المؤلمة مثل قرصة الذيل.

ضع على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم بعد التخدير. ثم قم بتغطية عيون بمرهم واقي للعيون للحفاظ على رطوبة العينين. يجب أن تكون جميع الأدوات الجراحية قد تم تعقيمها أو تعقيمها باستخدام معقم خرز زجاجي لتطهير الأدوات عن طريق نقعها في 70٪ من الإيثانول.

باستخدام المقص ، قم بإزالة الشعر من فروة رأس ، ثم تطهير المنطقة باستخدام محلول اليود بوفيدون بنسبة 10٪ و 70٪ الإيثانول. ابدأ الجراحة باستخدام مقص صغير لعمل شق في خط الوسط في فروة الرأس ، بدءا من أربعة إلى خمسة ملليمترات ، وخلفي إلى الجمجمة والتقدم إلى الأمام إلى مقدمة العينين. يجب أن يكون هذا الشق طويلا بما يكفي بحيث لا يتداخل الجلد مع لصق اللوحة التي تعمل على تثبيت رأس الماوس أثناء تصوير الفوتونين.

بعد ذلك ، ضع 100٪ من الإيثانول قطعة قطن معقمة لتجفيف الأغشية أعلى الجمجمة. اكشطها باستخدام ملاقط دقيقة. إذا لم تتم إزالة الأغشية ، فسيكون مرفق لوحة الرأس غير مستقر.

تحت نطاق التشريح ، حدد المنطقة المراد تخفيفها. تجنب مناطق الاهتمام الموجودة مباشرة فوق خيوط الجمجمة لأن الجمجمة أقل استقرارا في هذه المناطق وستتداخل الأوعية الكبيرة والسحايا الكامنة مع التصوير المرسل إلى نافذة العرض في منطقة الاهتمام. ثم مرة أخرى ، باستخدام قطعة قطن ، جرب الجمجمة مرة أخرى باستخدام محلول 10٪ من كلوريد الحديديك.

ضع طبقة رقيقة من رابطة بيرما ، تسعة 10 غراء حول حواف نافذة العرض أسفل لوحة الرأس. ثم ضع اللوحة فوق منطقة الاهتمام على جمجمة بضغط خفيف لربط الغراء. ضع كمية صغيرة من الأكريليك حول حافة نافذة العرض باستخدام حقنة.

أخيرا ، ضع كمية صغيرة من Tite 4 54 على حواف نافذة العرض. لمنع التسرب. قم بربط لوحة الرأس بحامل وتحقق من الثبات تحت مجهر التشريح عن طريق التحقيق برفق باستخدام زوج من الملقط ، يجب ألا تكون هناك حركة للجمجمة بالنسبة للوحة الرأس.

ضع قطرة من المحلول الملحي على نافذة العرض للتأكد من عدم وجود تسريبات استعدادا للتخفيف. جفف الجمجمة باستخدام مزيج من مسحات القطن المعقمة والهواء المضغوط. قم بترقيق الجمجمة باستخدام مثقاب IRF 0 0 7 في مثقاب صغير إلى اثنين.

عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة. ابدأ بلطف شديد في ترقق منطقة دائرية قطرها من 2 إلى 2.5 ملم. استخدم فقط حركات الكنس الخفيفة الموازية للجمجمة تقريبا.

لا تستخدم الضغط المباشر لأسفل. توقف عن الحفر كل 20 إلى 30 ثانية لإزالة غبار العظام باستخدام الهواء المضغوط. تسمح هذه الفواصل في الحفر للجمجمة بالتبريد بحيث لا يكون هناك ضرر ناتج عن الحرارة في أنسجة المخ الأساسية.

مع تقدم الحفر ، لاحظ الانتقال إلى طبقة العظام الشوكية الرطبة المسماة Diplo. بمجرد الوصول إلى هذه الطبقة ، توخي الحذر الشديد مع المثقاب. تحقق من نحافة الجمجمة من حين لآخر عن طريق وضع محلول ملحي على المنطقة الرقيقة وعرضها تحت نطاق التشريح.

سيمكن المحلول الملحي من تبديد الحرارة. عندما تكون الجمجمة ضعيفة ، تصبح الأوعية الدموية الأصغر مرئية. استخدم شفرة دقيقة للأسنان لتحقيق التخفيف النهائي تحت المحلول الملحي.

توفر الشفرة الدقيقة ردود فعل ملموسة أكثر حول استقرار الجمجمة. هذا يسمح بمستحضرات أرق بكثير من المثقاب وحده. سمك الجمجمة الأمثل للتصوير هو 10 إلى 30 ميكرومتر.

عملية التخفيف بأكملها عادة ما بين 15 و 30 دقيقة. تحقق من نحافة الجمجمة تحت مضان epi عدة مرات أثناء عمل نافذة جمجمة رفيعة. تعطي حدة وعمق الخلايا الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية المرئية مؤشرا جيدا على متى تكون النافذة جاهزة للتصوير.

بمجرد أن تصبح النافذة جاهزة ، استخدم ماصة زجاجية قطرها ملليمتر واحد لوضع قطرة صغيرة من غراء الأكريليك Cy على منطقة الجمجمة الرقيقة وقم بخفض قطعة من زجاج الغطاء عليها بعناية. ثم اضغط برفق على الجمجمة للضغط على أي غراء زائد ، وتجنب تكوين الفقاعات بينها وبين زجاج الغطاء ، مما قد يعيق الرؤية. بمجرد أن يجف ، استخدم شفرة دقيقة لإزالة أي غراء متبقي أعلى زجاج الغطاء بعناية استعدادا لتصوير الفوتونين.

قم بتغطية النافذة القشرية الرقيقة للجمجمة بالمحلول الملحي وحدد موقع منطقة الاهتمام تحت مضان epi. لتمكين التصوير اللاحق للمنطقة ، التقط صورة باستخدام كاميرا التصوير الفوتوغرافي للتصوير. يظهر هنا يتم استخدام مجهرين للصور حسب الطلب مع ليزر ti من الياقوت المضبوط على 920 نانومتر.

يتم الكشف عن التألق باستخدام أنبوب مضاعف الصور أو PMT في وضع الكشف عن المجال بأكمله ومرشاح البث 5 81 80. يتم استخدام عدسة غمر الماء 20 × طوال جلسة التصوير. اضبط الحد الأقصى لإخراج طاقة الليزر للهدف بين 50 و 65 مللي واط.

بعد ذلك ، حدد منطقة الاهتمام إما طبقة قشرية واحدة أو اثنتين حتى 150 ميكرومتر تحت سطح التقشير. لتسهيل إعادة التصوير، التقط صورا لمجال الرؤية نفسه بحجم تكبير/تصغير رقمي واحد x وثلاثة x. يمكن أن تكون الأوعية الدموية بمثابة معالم للعثور بسهولة على نفس مجال الرؤية أثناء جلسات التصوير اللاحقة.

تحت تكبير ثلاثة x ، احصل على Zacks متعددة بخطوات 80 إلى 90 Z لكل منها وخطوة 0.69 ميكرومتر كل خمس دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة. يتيح ذلك أخذ عينات جيدة من مورفولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة وسلوكها بمرور الوقت بين عمليات الاستحواذ على Zacks ، والتحقق من مستوى المحلول الملحي وعمق التخدير. إذا لزم الأمر ، يمكن إعطاء جرعة معززة من ثلث الجرعة الأصلية من كوكتيل التخدير أثناء الإجراء لمنع ترسب الترسب على المحقنة والإبرة خلال أيام الحقن قبل الحقن.

قم بتصويبه بالبطانة الداخلية لإبرة قياس 35 وحقنة صغيرة الحجم سعة 10 ميكرولتر عن طريق سحب محلول التحجيم حتى تملأ كل من الإبرة والحقنة. اترك المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم أفرغ المحلول من المحقنة ، وقم بإزالة المكبس واترك المحقنة والإبرة تجف تماما. أخيرا ، اغسل المحقنة والإبرة جيدا بالماء منزوع الأيونات.

بمجرد عزلتها ، يمكن استخدام حقنة وإبرة لأكثر من ستة أشهر قبل أن تكون إعادة الترميز ضرورية. في يوم الحقن ، ضع قطرة صغيرة من محلول TAT على شريحة زجاجية منعزلة. باستخدام طرف ماصة سيليكون، قم بتحميل الكمية المطلوبة من المحلول في حقنة الحجم الصغير من هذه القطرة.

باستخدام مثقاب ، قم بإجراء بضع قحف صغير بقطر 0.5 ملم ، إما منقاري بثلاثة ملليمترات أو جانبي للنافذة القشرية الرقيقة للجمجمة حيث تم الحصول على صورتين فوتونيين. لتحقيق ذلك ، قم بترقيق الجمجمة بعناية. ثم استخدم ملقطا حادا لإزالة الطبقة الرقيقة من العظام.

استخدم مناور دقيق لمحاذاة الإبرة والحقنة بحجم 35 مع حج القحف. ثم قم بتقديم الإبرة بعناية إلى عمق 700 إلى 900 ميكرومتر تحت سطح القشرة. قم بتوصيل ثلاثة ميكرولترات بمعدل 80 نانولتر في الدقيقة باستخدام مضخة حقنة يتم التحكم فيها بواسطة معالج دقيق.

يوضح هذا الشكل GFP المسمى الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم تصورها باستخدام تصويرين فوتونيين بعد زرع النافذة القشرية الرقيقة للجمجمة ، على بعد حوالي 50 ميكرومتر تحت سطح التقشير. يوضح قسمان الفوتونيان الفرديان اللذان تم التقاطهما في اليوم صفر ، بعد 15 إلى 30 دقيقة من زرع النافذة القشرية الرقيقة للجمجمة ، بالإضافة إلى تلك التي تم التقاطها بعد سبعة و 17 يوما ، أن النوافذ تظل صافية بينما تظل الخلايا الدبقية الصغيرة نشطة في حالة عدم وجود إهانات التهابية. هذا يسلط الضوء على فائدة هذه الطريقة للتحقيق في كل من التفاعلات الطبيعية والالتهابية بين الخلايا المستجيبة المناعية وأنواع الخلايا العصبية الأخرى.

في الجسم الحي ، تظهر الإسقاطات Z التي تم التقاطها في ست و 24 ساعة بعد حقن السم العصبي لفيروس نقص المناعة البشرية TAT تغيرات مورفولوجية ملحوظة في الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة. مما يدل على قدرتنا على دراسة التغيرات المورفولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي في النماذج الحادة والمزمنة للالتهاب العصبي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير نافذة جمجمة رفيعة واستخدامها لدراسة الالتهاب العصبي عند القيام بهذا الإجراء.

من المهم أن تتذكر أن تأخذ وقتك عند العناية بالجمجمة لمنع أي ضرر ناتج عن المستحضر نفسه. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.