تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

تستخدم هذه الإجراءات التصوير المجهري للخلايا الحية لتصور انتقال فيروس HIV المسمى بـ GFP عبر المشابك الفيروسية بين خلايا T لقطط jerk التي تعبر عن HIV وخلايا T أولية غير مصابة. يبدأ اختبار الانتقال من خلية إلى أخرى بنقل HIV gag IG FP، وهو مستنسخ فلوري معدٍ من HIV-1، إلى خلايا T لقطط jerk، حيث تقوم هذه الخلايا المنقولة بالتعبير عن HIV gag IG FP. بعد ذلك، تُخلط خلايا قطط jerk مع خلايا T أولية غير مصابة وموسومة بـ C-M-T-M-R، ثم يتم وضعها في غرفة تصوير حيث يمكن ملاحظة انتقال HIV المسمى بـ GFP عبر المشبك الفيروسي.

تُحلل البيانات الناتجة باستخدام برنامج لتحليل الصور للكشف عن تفاصيل انتقال فيروس HIV عبر التشابكات الفيروسية للخلايا التائية. مرحباً، اسمي بنجامين ديل من مختبر بن تشن في قسم الطب بمدرسة جبل سيناء للطب. اسمي غريغ مكنيرني من مختبر الدكتور توماس هيوزر في مركز NSF للمناظير الحيوية في المركز الطبي بجامعة كاليفورنيا ديفيس.

وأنا ديانا طومسون، أيضاً من مختبر الدكتور توماس هيوزر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير الانتقال الخلوي لفيروس HIV-1 باستخدام المجهر البؤري الحي. في هذا الإجراء، يتم ترانسفكشن خلايا Jurkat باستخدام مستنسخ جزيئي معدٍ لفيروس HIV-1؛ ويجب أن يتم ذلك بواسطة موظفي المختبر المدربين الذين يعملون في مرافق السلامة البيولوجية المعتمدة.

يمكن تنفيذ البروتوكول الموضح هنا في غرف زراعة الأنسجة من المستوى الثاني المطور (Level two plus) أو المستوى الثالث من السلامة البيولوجية. ويجب الحصول على موافقة مكتب السلامة البيولوجية المؤسسي المحلي للعمل مع فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المعدي في مرافق التصوير. يتم الحفاظ على خلايا jerk cat التي ستُستخدم كخلايا مانحة بتركيز يتراوح بين 2 × 10⁵ و 8 × 10⁵ خلية/مللتر.

في مستنبت خلايا jerk cat، يؤدي تركيز الخلايا في الوسط الذي يتجاوز 8×10⁵ خلية/مل إلى انخفاض في كفاءة عفن (trans efficiency). لبدء الإجراء، قم بنقل البلازميد الفيروسي HIV gag IGFP إلى 5×10⁶ من خلايا jerk cat باستخدام طريقة amax nucleo affection كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق، ثم اترك الخلايا لتتعافى طوال الليل. يتم تنقية الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي من طبقات البافي (buffy coats) للدم البشري الكامل عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام FICO.

يتم تنقية خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام طقم عزل خلايا T الموجبة لـ CD4. تُجمع خلايا T الموجبة لـ CD4 المنتقاة سلبياً من عمود مغناطيسي وتُزرع في وسط PMI الخاص بنا مع 10% FPS والمُدعم بـ 10 units/mL من recombinant human IL-2. يمكن أيضاً تقسيم خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 المعزولة إلى حصص وتجميدها بمساعدة حاويات التجميد المبرد. توضع حاويات التجميد في مجمد عند درجة حرارة -70 °C لمدة لا تقل عن ثلاث إلى أربع ساعات.

تُنقل الخلايا بعد ذلك إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد. والآن، بعد أن تم ترصيف خلايا Jurkat وعزل خلايا T الأولية المستهدفة والموجبة لـ CD4، يتم الانتقال إلى تنقية الخلايا ووسمها في اليوم التالي لعملية الترصيف. وتعبر خلايا Jurkat الآن عن بنية HIV الفلورية المعدية.

عند التعامل مع العينات المعدية، نرتدي معطف مختبر يغلق من الأمام وزوجين من القفازات. قم بإزالة الحطام الخلوي من الخلايا المنقولة جينيًا عن طريق الطرد المركزي فوق وسط fial high pack density. أولاً، قم بتوزيع 1.5 milliliters من fial pack في قاع أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

ثم قم بتغطية المادة المتدرجة بلطف باستخدام خلايا jerk hat المنقولة في حجم 5 mL من وسط PMI الخاص بنا. في هذه المرحلة، تكون خلايا jerk hat المنقولة قادرة على إنتاج فيروس HIV معدٍ. لذا، يجب تعقيم جميع رؤوس الماصات التي تلامس الخلايا التي تعبر عن HIV باستخدام محلول مبيض بتركيز 10%.

قبل التخلص من الأنبوب في الحاوية الموجودة داخل كابينة السلامة الحيوية، قم بتغطية الأنبوب ورش سطحه الخارجي بمحلول 70%ethanol ثم امسحه باستخدام منديل kim wipe جاف. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 400 Gs لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكابح. بعد عملية الطرد المركزي، استخدم ماصة لإزالة الخلايا بعناية من الواجهة الفاصلة للوسط وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 milliliter. خفف الخلايا باستخدام وسط PMI الخاص بنا ليصل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 GS لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، نقوم بتعليق الراسب في ثلاثة ملليلتر من وسط استنبات jerk hat وننقله إلى فجوة بحجم سنتيمترين من طبق يحتوي على ست فجوات. يوضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة حتى يحين وقت استخدامه في اليوم التالي. وفي مساء اليوم نفسه، يتم وسم خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 المستخدمة كخلايا مستهدفة لتمييزها عن الخلايا المانحة. أولاً، يتم تجميع 4 × 10⁶ من خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 في راسب عن طريق الطرد المركزي عند 400 Gs لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام 5 mL من PBS ثم أعد تعليقها في 2 mL من PBS، وأضف cell tracker orange ليصل التركيز النهائي إلى 1.5 µM، ثم حضنها عند 37 °C لعدة دقائق. وعند انتهاء فترة التحضين، أضف 8 mL من وسط chica الكامل، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 ×g لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الخلايا في 3 mL من الوسط الغذائي الكامل المضاف إليه 10 units/mL من IL-2 وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. بعد فترة التحضين الليلية، تصبح الخلايا المانحة والمستهدفة جاهزة لتجربة النقل من خلية إلى أخرى. قبل إعداد تجربة النقل من خلية إلى أخرى، قم بتجهيز غرفة التصوير لعزل المنصة ضد تقلبات درجات الحرارة في الغرفة.

ولحجب ضوء الغرفة في الخلفية، يُغطى نظام تسخين المجهر بالكامل بغطاء أسود كبير، مما يؤدي إلى تكوين جيب هوائي عازل حول النظام. ويتم الحفاظ على غرفة التصوير عند درجة حرارة مستقرة تبلغ 37 °C باستخدام سخان ثرموستاتي مع طرف مزدوج حراري من النوع T يوضع بجوار العينة للتغذية الراجعة لدرجة الحرارة. يتم التسخين المسبق لمدة 30 دقيقة قبل تثبيت العينة.

يُستخدم التصوير المجهري البؤري ذو القرص الدوار باستخدام مجهر ضوئي مقلوب لإنشاء صور بؤرية ثلاثية الأبعاد لانتقال فيروس HIV من خلية إلى أخرى. يتم التحكم في جميع الأجهزة وعمليات الحصول على الصور، بما في ذلك المنصة Z، بواسطة برنامج and or IQ الإصدار 1.8. يتم إجراء المسح بواسطة وحدة التصوير البؤري ذات القرص الدوار CS U 10 التي تستخدم في آن واحد أكثر من 800 بقعة بؤرية لزيادة معدل المسح بشكل كبير لتعزيز سرعتها. تشتمل وحدة CS U 10 على كاميرا ذات جهاز اقتران شحني مضاعف للإلكترونات عالية الحساسية للسماح بالتصوير السريع في ظروف الإضاءة المنخفضة، مما يقلل من كل من التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

يعد مصدر ضوء الفلورة ليزر غاز أيونات الأرغون والكريبتون متعدد الأطوال الموجية. ويُستخدم مرشح بصري قابل للضبط من نوع An and or Oko أو A OTF لاختيار الأطوال الموجية المطلوبة، وهي 488 nanometers و 568 nanometers في هذه الحالة، مع التحكم في قدرتها للحد من التبييض الضوئي وإطالة وقت التصوير. يقوم A OTF بإغلاق الليزر بسرعة بعد كل تعريض يستغرق من 15 إلى 30 millisecond عندما لا تكون الكاميرا في مرحلة التقاط الصور، وذلك لتجنب التعريض غير الضروري أثناء نقل الصور من كاميرا E-M-C-C-D إلى الكمبيوتر.

يتم دمج ضوء الليزر في نظام القرص الدوار باستخدام مرآة Dichroic رباعية النطاق 4 0 5 4 88 5 68 6 47، ويتم فصل الانبعاث الفلوري حسب الطول الموجي باستخدام مرآة diic طويلة التمرير بطول 560 nanometer مع مقسم صور. يتم ترشيح القناة الخضراء باستخدام مرشح تمرير نطاق 525 over 50 nanometer، بينما يتم ترشيح القناة الحمراء باستخدام مرشح تمرير نطاق 609 over 54 nanometer. يتم عرض القناتين جنبًا إلى جنب على كاميرا E-M-C-C-D.

بينما يتم تسخين غرفة التصوير، قم بتحضير الخلايا لتجربة نقل الخلايا من خلية إلى أخرى. استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لعد خلايا ette التي تعبر عن HIV gag IGFP. ضع مقياس كرات الدم في طبق بتري لتجنب التعرض المباشر للخلايا التي تعبر عن الفيروس.

اغسل الخلايا باستخدام وسط غذائي مستقل عن ثاني أكسيد الكربون، ثم أعد تعليقها في وسط تصوير الخلايا الحية بتركيز يتراوح من 1 إلى 3 × 10⁷ خلية لكل ملليلتر. إن استخدام وسط غذائي مستقل عن ثاني أكسيد الكربون يلغي الحاجة إلى غرفة بيئية تحتوي على ثاني أكسيد الكربون من أجل التصوير.

قم بعدّ الخلايا وغسلها وإعادة تعليق خلايا T الأولية الملحقة الموجهة ضد CD4 الموجبة كما تم توضيحه سابقاً لخلايا Jurkat. بعد ذلك، ابدأ عملية النقل من خلية إلى أخرى عن طريق خلط 20 µL من خلايا Jurhat المنقولة بجين HIV gag-GFP مع 40 µL من خلايا T الأولية الملحقة الموجهة ضد CD4 الموجبة، ثم قم بتحميل 50 µL في غرفة EBD مجهرية نفاذة للغاز ومعالجة للمزارع النسيجية. أغلق الغرفة باستخدام السدادات وثبّتها عن طريق لف الواجهة الفاصلة بين السدادة وغرفة EBD بشريط parafilm.

امسح غرفة التصوير باستخدام منديل كيميائي مبلل بـ 70%ethanol واتركها لتجف في الهواء لفترة وجيزة داخل غطاء التدفق الصفحي. انقل غرفة التصوير المختومة في حاوية محكمة الغلق لتجنب التعرض العرضي. وفي حال سقوط الغرفة أثناء النقل، فقم فوراً بعد تحميل غرفة تصوير IBD بالخلايا بتثبيت الجهاز على المجهر.

التقط صوراً لأزواج الخلايا باستخدام عدسة شيئية غمر زيتية بفتحة عددية 60 x 1.42 NA، حيث إن الفتحة العددية العالية تحسن الدقة بشكل كبير لزيادة سرعة الحصول على مجموعات الصور ثلاثية الأبعاد (3D image stacks). قم بقص منطقة التسجيل في كاميرا EM CD لتشمل المنطقة المجاورة لزوج الخلايا مباشرة. علاوة على ذلك، قد يساعد استخدام خطوة Z كبيرة تتراوح بين 0.45 و 0.75 micrometers في تسريع عملية الحصول على الصور في ظل هذه الظروف.

يتم تسجيل الصور بشكل مستمر على فترات تتراوح من 20 إلى 60 دقيقة. ويمكن أن يمتد التصوير المتكرر لنفس بقعة العينة حتى ست ساعات مع حدوث حد أدنى من التبييض الضوئي عند الالتقاط. يتكون كل جزء من البيانات من عشرات الآلاف من الصور التي قد تشغل إجماليًا من 5 إلى 20 جيجابايت.

لتسهيل نقل وتحليل الملفات الكبيرة، يتم تقسيم كل ملف وتصديره كأجزاء من ملفات صور TIFF بحجم غيغابايت واحد. ولتحليل الصور المكتسبة، استخدم أيًا من عدة برامج تحليل الصور المتاحة. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تفاصيل تحليل الصور، بما في ذلك تصحيح تبييض الكثافة والتتبع التلقائي واليدوي لنقاط gag puncta.

خلال 10 إلى 15 دقيقة من المزج، يمكن رؤية خلايا jerk cat التي تعبر عن HIV gag IGFP وهي تلتصق بخلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 من خلال التصوير. ومن خلال هذه المترافقات، يمكن تقييم تحركات نقاط gag في الخلايا المصابة وكذلك في الخلايا المستهدفة. وبعد تشكل المشبك، وفي غضون 30 دقيقة إلى ثلاث ساعات، يمكن ملاحظة انتقال نقاط gag IG FP إلى الخلايا المستهدفة المحددة بـ cell tracker.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصور انتقال HIV من خلية إلى أخرى بين الخلايا التائية. عند إجراء هذه العمليات، من المهم جداً تذكر مراعاة كافة احتياطات المستوى الثاني المعزز من السلامة البيولوجية أو المستوى الثالث من السلامة البيولوجية عند التعامل مع العينات التي تعرضت لخلايا تعبر عن HIV. تذكر أيضاً استخدام خلايا JCA مصانة جيداً وDNA خالٍ من الذيفانات الداخلية لتحسين عملية عفن الخلايا.

هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.