الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

والانبثاث الرئة التجريبية وCTL نموذج الفأر المناعي لتحليل التفاعل خلية ورم الخلايا التائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص فعالية العلاج المناعي للخلايا التائية الخاصة بالورم في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق زرع الخلايا السرطانية عن طريق حقن وريد الذيل الجانبي للفئران من أجل إنشاء نقائل الرئة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في علاج الفئران الحاملة للورم بالخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا الخاصة بالورم.

الخطوة الأخيرة هي استخدام حبر الهند كوسيلة لتصور عقيدات الورم وتحديدها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح CIE للعلاجات المختلفة من خلال قياس حجم الورم وتحديد عدد عقيدات الورم. مرحبا ، اسمي ماري زيمرمان وأنا عضو في مختبر الدكتور كيفن لو في كلية الطب في جورجيا.

مرحبا ، اسمي شيلين هو ، أنا طالبة في السنة الثانية وأعمل أيضا في مختبر الدكتور لو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق التقليدية مثل منحنيات البقاء على قيد الحياة هي أن هذا الإجراء نوعي وكمي. يمكن أن يمتد تأثير التقنيات إلى علاج السرطان لأنه يحاكي العلاج المناعي للخلايا التائية بالتبني في مرضى السرطان البشريين.

لذلك دعونا نبدأ في اليوم السابق لحقن الخلايا السرطانية ، قم بزرع قارورة T 75 مع ما يصل إلى واحد في 10 إلى السابع. التقت خلايا CMS الأربعة في 10 ملليلتر من وسط RPMI يحتوي على 10٪ مصل. للحصول على خلايا سرطانية سريعة النمو ، تحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في يوم الحقن.

قم بإزالة الوسط واشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم حصاد الخلايا السرطانية باستخدام 0.05٪ تريبسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أوقف التفاعل ب 10 ملليلتر من وسط RPMI يحتوي على 10٪ مصل. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل.

قم بتدوير الخلايا بسرعة 1300 دورة في الدقيقة في جهاز طرد مركزي RT لمدة ثلاث دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة snat ، وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من XHB Ss الطازج لغسلها. ثم قم بالدوران مرة أخرى وأعد التعليق بنفس الطريقة.

عد الخلايا السرطانية على كتلة الدم. مقياس الخلوي. تمييع الخلايا في HBSS بحيث يتم تعليق الخلايا المطلوبة لكل حقنة. بحجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر ، قم بتسخين فئران B SEA البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع في دورق مغمورة في ماء دافئ.

لتوسيع الوريد الذيل ، ضع الفأر في مقبض وريد الذيل على المقعد. استخدم حقنة ميكروس لحقن 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية في الوريد الذيل الجانبي. استخدم تقنية الصرف الصحي لتجنب العدوى بعد الحقن.

استخدم ضغطا طفيفا على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. أعد الفأر إلى القفص واترك الورم ينمو إلى المرحلة المرغوبة. في يوم النقل، قم بتدوير الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا أو CTLs المحضرة.

كما هو موضح في النص ، انقل جميع الخلايا من لوحة واحدة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، دون السماح للحجم بتجاوز أكثر من ثلثي الأنبوب. أدخل ماصة باستور معقمة في الأنبوب المخروطي وفصل الخلايا الليمفاوية الطبقية. متوسط أو LSM تحت الخلايا حتى يقترب الحجم الإجمالي من 14 ملليلترا.

احرص على عدم إزعاج الطبقات. جهاز طرد مركزي 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم الفرامل لإبطاء الدوار بعد الدوران ، انقل CTLs إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

أضف HBSS إلى حجم حوالي 10 ملليلتر. لغسل. عد الخلايا تدور لأسفل عند 1300 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعادة تعليق HBSS إلى كثافة الخلية المطلوبة للحقن.

الحفاظ على الحجم الكلي لكل حقنة عند 100 ميكرولتر. استخدم نفس تقنية حقن الذيل كما رأينا سابقا في هذا الفيديو. لحقن CTLs في الفئران الحاملة للورم ، أعد الفأر إلى القفص واسمح ل CTLs بالتفاعل مع الورم.

عادة ما يتم التضحية بالفئران للتحليل بعد 14 إلى 21 يوما من علاج CTL. لتصور نقائل الرئة ، ضع فأرا مضحيا على ظهره على لوح الستايروفوم. قم بتثبيت الساقين لضمان الوصول دون عوائق إلى القصبة الهوائية.

رش الجانب البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول بدءا من منتصف البطن. استخدم المقص للقطع على طول خط الوسط من خلال القفص الصدري وصعودا نحو الغدد اللعابية. كشف القصبة الهوائية.

استخدم ملقطا لإزالة الأنسجة المحيطة بالقصبة الهوائية. قم بربط طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر أسفل القصبة الهوائية ممسكا بالطرف بيد واحدة. ارفع القصبة الهوائية برفق لأعلى وبعيدا عن الجسم.

قم بتدوير المنصة 180 درجة. استخدم حقنة سعة 50 ملليلتر لحقن الحبر الهندي في الرئتين عبر القصبة الهوائية. قم بتضخيم الرئتين تماما بالحبر حتى تشعر بمقاومة قوية.

استخدم المقص لقطع القصبة الهوائية. حرك زوجا من الملقط تحت الرئتين وارفعهما من الماوس. اشطف الرئتين لفترة وجيزة في دورق ماء سعة لتر واحد في غطاء دخان كيميائي.

انقل الرئتين إلى صفراء زجاجية تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول FTI. ستظهر أنسجة الورم على شكل عقيدات بيضاء على الرئتين السوداء. بعد بضع دقائق ، يمكن الآن عد الأورام والبدء في محلول FTI إلى أجل غير مسمى. هنا.

رئتي الفئران المنقولة بسرطان الثدي. يظهر خط الخلية الرابع T واحد بقعا بيضاء تشير إلى الأورام. تظهر الفئران التي تم نقلها بثمانية مناعة سلبية سائدة ل K 79 E الإمكانات النقيلية المعززة للخلايا السرطانية.

تظهر هذه الصور تحليلا نسيجيا لفعالية العلاج المناعي بنقل CTL. أظهرت الفئران الحاملة للورم التي تم حقنها بالمحلول الملحي أورام متعددة بعد ستة أيام يشار إليها بالسهام. من ناحية أخرى ، أظهرت الفئران التي تم حقنها بخلايا تائية خاصة بالورم انخفاضا في الأورام في نفس التجربة.

يعطي علاج الحبر الهندي طريقة أبسط لقياس فعالية نقل CTL بالتبني. هنا تميز عقيدات الورم البيضاء الموجودة على الرئتين الحاملة للورم بوضوح عن الرئتين اللتين خضعت بنجاح لنقل التبني CTL وعد العقيدات بدرجة من القياس الكمي غير ممكنة مع الأنسجة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسخين الفئران لحقن وريد الذيل بشكل أسهل وأكثر دقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم فعالية العلاج من خلال هذا الإجراء البسيط لتحديد حجم الورم وأعداده. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.