الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص فعالية العلاج المناعي عن طريق النقل التكيفي للخلايا التائية النوعية للأورام في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زرع الخلايا الورمية عبر الحقن في الوريد الجانبي للذيل للفئران من أجل إحداث نقائل رئوية. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي علاج الفئران الحاملة للأورام بالخلايا التائية السامة للخلايا CTLs النوعية للأورام.

تتمثل الخطوة النهائية في استخدام حبر الهند كوسيلة لتصور وتحديد كمية العقد الورمية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح كفاءة التثبيط الورمي (CIE) لعلاجات مختلفة من خلال قياس حجم الورم وتحديد عدد العقد الورمية. مرحباً، اسمي ماري زيمرمان وأنا عضوة في مختبر الدكتور كيفن لو في كلية الطب بجورجيا.

مرحباً، اسمي شيلين هو. أنا طالبة في السنة الثانية وأعمل أيضاً في مختبر الدكتور لو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق التقليدية، مثل منحنيات البقاء، هي أن هذا الإجراء نوعي وكمي في آن واحد. ويمكن أن تمتد تطبيقات هذه التقنيات إلى علاج السرطان لأنها تحاكي العلاج المناعي بالتبيّن للخلايا التائية لدى مرضى السرطان من البشر.

لنبدأ الآن؛ في اليوم الذي يسبق حقن الخلايا الورمية، قم بزراعة قارورة T 75 واحدة بما يصل إلى 1 × 10⁷ من خلايا CMS4met في 10 milliliters من وسط RPMI الذي يحتوي على 10% serum. وللحصول على خلايا ورمية سريعة النمو، يتم التحضين طوال الليل عند 37 °C في يوم الحقن.

أزل الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS، ثم احصد الخلايا الورمية باستخدام trypsin EDTA بنسبة 0.05% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أوقف التفاعل بإضافة 10 milliliters من وسط RPMI الذي يحتوي على 10% serum. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي.

قم بتركيز الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1300 RPM باستخدام جهاز centrifuge من نوع val legend RT لمدة ثلاث دقائق. في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة السائل الطافي، وأعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من محلول one XHB Ss الطازج لغسلها. ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأعد التعليق بنفس الطريقة.

قم بعدّ الخلايا الورمية باستخدام مقياس كرات الدم (hemo.Cytometer). خفف الخلايا في محلول HBSS بحيث يتم إعادة تعليق الخلايا المطلوبة لكل حقنة. في حجم إجمالي قدره 100 µL، قم بتدفئة فئران B SEA التي يتراوح عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع في دورق مغمور في ماء دافئ.

لتوسيع الوريد الذيلي، ضع الفأر في أداة تثبيت الوريد الذيلي على طاولة المختبر. استخدم حقنة دقيقة لحقن 100 µL من الخلايا الورمية في الوريد الذيلي الجانبي. اتبع تقنية التعقيم لتجنب حدوث عدوى بعد الحقن.

طبق ضغطاً خفيفاً على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. أعد الفأر إلى القفص واترك الورم ينمو حتى يصل إلى المرحلة المطلوبة. في يوم النقل، استخدم الماصة لسحب السائل للأعلى وللأسفل لإعادة تعليق الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا المنقاة أو CTLs التي تم تحضيرها.

كما هو موضح في النص، انقل جميع الخلايا من طبق واحد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، مع مراعاة ألا يتجاوز الحجم ثلثي الأنبوب. أدخل ماصة باستور معقمة في الأنبوب المخروطي وأضف وسط فصل الخلايا الليمفاوية أو LSM فوق الخلايا حتى يقترب الحجم الإجمالي من 14 milliliters.

احرص على عدم تعكير الطبقات. قم بالطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم المكابح لإبطاء الدوار بعد الدوران، ثم انقل الـ CTLs إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 milliliter.

أضف HBSS حتى يصل الحجم إلى 10 ملليلتر تقريبًا، وذلك لغرض الغسل. قم بعدّ الخلايا ثم قم بطردها مركزياً بسرعة 1300 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليقها في HBSS للوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة للحقن.

مع الحفاظ على الحجم الإجمالي لكل حقنة عند 100 microliters. استخدم نفس تقنية الحقن في الذيل كما ظهر سابقاً في هذا الفيديو. لحقن الـ CTLs في الفئران الحاملة للأورام، أعد الفأر إلى القفص واترك الـ CTLs تتفاعل مع الورم.

عادةً ما يتم التضحية بالفئران للتحليل بعد 14 إلى 21 يوماً من العلاج بـ CTL. ولتصوير نقائل الرئة، ضع الفأر الذي تمت التضحية به على ظهره فوق لوح من الستيروفوم. قم بتثبيت الأرجل بالدبابيس لضمان وصول غير مقيد إلى الرغامي.

رش الجانب البطني بـ 70%ethanol بدءاً من منتصف البطن. استخدم المقص للقص على طول الخط الناصف عبر القفص الصدري وصعوداً باتجاه الغدد اللعابية. قم بكشف القصبة الهوائية.

استخدم الملقط لإزالة الأنسجة المحيطة بالرغامي. مرر رأس ماصة سعة 200 µL تحت الرغامي مع الإمساك بالرأس بإحدى اليدين. ارفع الرغامي برفق بعيداً عن الجسم.

قم بتدوير المنصة بمقدار 180 درجة. استخدم حقنة سعة 50 milliliter لحقن حبر الهند في الرئتين عبر الرغامي. قم بنفخ الرئتين تماماً بالحبر حتى تشعر بمقاومة قوية.

استخدم مقصاً لقطع الرغامي. مرر ملقطاً تحت الرئتين ثم ارفعهما خارج جسم الفأر. اشطف الرئتين لفترة وجيزة في بيكر سعة لتر واحد من الماء داخل خزانة استخلاص الغازات الكيميائية.

انقل الرئتين إلى وعاء زجاجي يحتوي على خمسة ملليلترات من محلول FTI. ستظهر الأنسجة الورمية على شكل عقد بيضاء على الرئتين السوداوين. بعد بضع دقائق، يمكن الآن عد الأورام وبدء حفظها في محلول FTI إلى أجل غير مسمى.

رئات لفئران تم نقل سرطان الثدي إليها. يُظهر الخط الخلوي 4T1 بقعًا بيضاء تشير إلى وجود الأورام. وتُظهر الفئران التي نُقل إليها IRF8 dominant negative immune to K79E تعزيزًا في القدرة النقيلية للخلايا الورمية.

تُظهر هذه الصور تحليلاً نسيجياً لفعالية العلاج المناعي عن طريق النقل التبني لـ CTL. أظهرت الفئران الحاملة للأورام والتي حُقنت بمحلول ملحي وجود أورام متعددة بعد ستة أيام، كما تشير الأسهم. وفي المقابل، أظهرت الفئران التي حُقنت بخلايا T النوعية للأورام انخفاضاً في الأورام في التجربة ذاتها.

توفر المعالجة بحبر الهند طريقة أبسط لقياس فعالية النقل التبني لـ CTL. هنا، تميز العقد الورمية البيضاء في الرئات الحاملة للأورام بوضوح عن الرئات التي خضعت بنجاح للنقل التبني لـ CTL، ويتيح عدّ هذه العقد درجة من القياس الكمي غير ممكنة عن طريق الفحص النسيجي. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تدفئة الفئران لتسهيل حقن الوريد الذيلي وجعله أكثر دقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم فعالية العلاج من خلال هذا الإجراء البسيط لقياس حجم الأورام وأعدادها. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.