في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج لإصابة الكلى الحادة في سمك الزيبرا باستخدام جليكوسيد AMG جنتاميسين كسم كلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن الجنتاميسين في الوريد الرئيسي المشترك ليرقات سمك الزيبرا بعد يومين من الإخصاب. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تقييم أنماط emus المظهرية في اليرقات المحقونة بعد أربعة أيام من الإخصاب.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في معالجة أجنة أسماك الزيبرا بعد أربعة أيام من الإخصاب لإجراء صبغ كيميائي نسيجي مناعي باستخدام جسم مضاد لـ kidney tubule epithelium am. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تقطيع يرقات أسماك الزيبرا إلى شرائح وفحص الأنابيب التالفة الناتجة عن فقدان القطبية الخلوية واختلال بنية الأنابيب. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر قطاعات الأنابيب الكلوية التالفة من خلال الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام جسم مضاد لظهارة الكلية.

مرحباً، أنا كارالا سان كوزينتينو من مختبر نيل هاري في قسم البيولوجيا التنموية بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لكم اليوم إجراءً للحقن المجهري لمضاد الجنتاميسين (Gentamycin) من مجموعة الأمينوغليكوزيد في يرقات سمك الزيبرا بعد يومين من الإخصاب. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتحفيز إصابة كلوية حادة في يرقات سمك الزيبرا.

فلنبدأ الآن. ابدأ بتزويج أسماك الزيبرا البالغة قبل ثلاث ليالٍ من التجربة المخطط لها. ولتحديد مرحلة الأجنة في اليوم الثاني بعد الإخصاب، قم بتحضير وسط E3 باستخدام 5 mM من كلوريد الصوديوم، و0.17 mM من كلوريد البوتاسيوم، و0.33 mM من كلوريد الكالسيوم، و0.33 mM من كبريتات المغنيسيوم، ثم اجمع الأجنة وضعها في طبق بتري يحتوي على ماء E3 دافئ في حاضنة عند درجة حرارة 28.5 °C.

أزل أي أجنة ميتة من طبق بتري في نهاية اليوم الأول. وزع الأجنة بحيث يكون هناك من 80 إلى 100 جنين في كل طبق بتري. جهز إبر الحقن الزجاجية عن طريق سحب الأنابيب الشعيرية حتى يصل القطر النهائي إلى حوالي 10 إلى 20 ميكرون باستخدام جهاز سحب الأقطاب الكهربائية.

بعد السحب، ضع الشعيرة تحت مجهر تشريحي واستخدم مسطرة لتحديد عشرة خطوط تقريباً بطول 1 mm على طول الإبرة باستخدام قلم تحديد دائم. احفظ الإبر في أطباق بتري كبيرة على منحدرات طينية. بعد ذلك، قم بتجهيز ماصة التثبيت عن طريق التسخين باللهب.

صقل طرف شعيرة زجاجية من البوروسيليكات رقيقة الجدران. أمسك الشعيرة الزجاجية باستخدام ملقط طويل وقم بتسخين طرف الشعيرة بوضعها عمودياً فوق المخروط الداخلي الأزرق الفاتح للهب لمدة ثانية إلى ثانيتين. قم بتدوير الشعيرة للحصول على صهر متساوٍ.

كرر هذه العملية عدة مرات، ثم افحص الشعيرية باستخدام الميكرومتر المسرحي. يجب أن يتراوح قطر الشعيرية بين 0.4 إلى 0.5 millimeters. بعد تحضير الشعيريات والحوامل، املأ مضخة المحقنة المجهرية اليدوية بالزيت المعدني وفقاً للتعليمات الواردة من الشركة المصنعة.

أدخل حامل الماصة في ذراع تحكم متصل بقاعدة مغناطيسية مثبتة على لوح حديدي. قم بتحضير 20 µL من خليط حقن السم الكلوي: 2.4 nL من Gentamicin و 17.6 nL من Lucifer yellow dextran في مجموعة التحكم rva.

يتم استبدال الجنتاميسين بمحلول ملحي. جهّز طبقين من أطباق بتري بقطر 30 مليمتر يحتوي كل منهما على 2 مليلتر من الزيت المعدني بالقرب من مجهر الحقن لوضع مخاليط السمية الكلوية والمجموعات الضابطة قبل عملية الحقن. قم بتحضير المخدر عن طريق إذابة 400 مليجرام من مسحوق التريكا في 97.7 مليلتر من الماء المقطر مرتين و2.1 مليلتر من محلول التريس بتركيز 1 مولار، مع ضبط القيمة إلى pH 7.

يُحفظ هذا المحلول المخزون في المجمد في عبوات سعة 4.2 milliliters. ولتطبيق الـ trica كمخدر، يتم تخفيف المحلول المخزون من trica بحجم 4.2 milliliter في 100 milliliters من E three ويُترك في درجة حرارة الغرفة. ولتجهيز اليرقات للحقن تحت مجهر تشريحي، تُزال الـ coons يدويًا باستخدام ملقط دقيق. ثم تُخدر يرقات zebrafish عن طريق نقلها إلى طبق بتري يحتوي على trica مُدفأة في درجة حرارة الغرفة.

يجب تعريض يرقات سمك الزيبرا لـ trica لمدة 15 دقيقة على الأقل. قبل البدء في عمليات الحقن المجهري، افتح طرف إبرة الحقن باستخدام شفرة حلاقة. أمسك الشفرة بزاوية طفيفة لإنشاء شطب، واقطع الطرف بحيث تحصل على فتحة طرف يبلغ قطرها حوالي 10 إلى 20 ميكرون.

قم بتشغيل مصدر الطاقة وإمدادات الهواء لجهاز الحقن المجهري. أدخل الإبرة في حامل الإبرة. املأ الإبرة عن طريق وضع قطرة بحجم 10 µL من محلول الحقن في طبق بتري المملوء بالزيت.

تحت المجهر، قم بتشغيل مضخة البيكو اليدوية وقم بتطهير طرف الإبرة. وفي القطرة، اضبط مضخة البيكو على وضع التنفيس لملء الإبرة. سيستغرق ذلك بضع دقائق.

إذا تحرك المحلول داخل الإبرة بسرعة كبيرة، فهذا يعني أن قطر الطرف كبير جداً ولن تكون عمليات الحقن دقيقة. بعد ملء الإبرة، اضبط مضخة البيكو (pico pump) على وضع التثبيت (hold) لمعايرة الإبرة، ثم اضبط مفتاح مضخة البيكو على وضع البوابة (gated). اضغط على دواسة القدم لتفريغ الإبرة وسجل الوقت الذي يستغرقه السطح الهلالي للسائل للانتقال من علامة مليمتر واحدة إلى العلامة التالية بالثواني؛ كرر هذه العملية ثلاث مرات واقسم متوسط الوقت على 30، وهو الحجم بالنانولتر المقابل للمسافة الخطية البالغة 1 مليمتر، وذلك للحصول على عدد الميلي ثانية المطلوبة لتوصيل 1 نانولتر من المحلول.

اضبط مقبض فترة المدى على هذا الرقم وانقل مفتاح توقيت البوابة إلى الوضع المؤقت (timed). الآن تم ضبط المضخة النبضية لإيصال نبضة من المحلول بحجم 1 nanoliter. بعد ذلك، ضع طبق بتري الذي يحتوي على اليرقات تحت المجهر.

جمّع اليرقات في مركز طبق بتري واضبط تركيز المجهر. ضع ماصة التثبيت في مضخة الحقنة المجهرية اليدوية على الجانب المقابل للمحقن المجهري، ثم حرّك طرفها نحو طبق بتري وصولاً إلى مستوى تركيز المجهر. قم بثنيها بزاوية ضحلة إلى حد ما بحيث يلامس طرف ماصة التثبيت قاع طبق بتري ويكون في وضع أفقي تقريبًا.

قم بتغيير التكبير إلى قوة أعلى في المجهر واستخدم رمشاً فائق الدقة بمقبض. لتثبيت يرقة سمكة الزيبرا بحيث يكون الجانب الظهري للأسفل ويكون المحّ قريباً جداً من ماصة التثبيت. أدر محرك الميكرومتر الذي يتحكم في مضخة الحقنة الدقيقة اليدوية عكس اتجاه عقارب الساعة لتثبيت يرقة سمكة الزيبرا عن طريق سحب المحّ إلى داخل ماصة التثبيت.

احرص على عدم تدوير الميكرومتر بشكل مفرط لأن المحّ قد ينفجر. وفي حال سحب الجنين بعمق زائد داخل ماصة التثبيت، ركز على الوريد الكاردينالي المشترك الآخذ في التشكل، والذي يقع فوق المحّ مباشرة تحت الجلد المحيطي، وهو موقع يتميز بتدفق دموي عالٍ. وباستخدام الملاعب الدقيق لجهاز الحقن.

وجه الإبرة نحو الوريد الرئيسي المشترك النامي. وعادةً ما يكون من الضروري سحب الإبرة قليلاً بعد الإدخال لأن الوريد الرئيسي المشترك يكون سطحياً للغاية. إذا تم تثبيت نير اليرقات بشكل صحيح باستخدام ماصة التثبيت، فلن تدور أثناء دخول الإبرة.

قم بحقن نانولتر واحد من المحلول عن طريق الضغط على دواسة القدم. بعد ذلك، حرر اليرقات من ماصة التثبيت وأعدها إلى ماء اليرقات. وللتحقق من نجاح الحقن المجهري، راقب وجود Lucifer yellow dextre في قلب يرقات zebrafish.

تحت المجهر الفلوري، يظل صبغ Lucifer yellow مرئياً في الجهاز الدوري لمدة 20 دقيقة تقريباً، ثم تُعاد اليرقات إلى وسط E3 طازج بعد أربعة أيام من الإخصاب. توضع ما بين 10 و15 يرقة من أسماك الزيبرا في قوارير زجاجية سعة 4 مل ويتم تثبيتها في 1 مل من الدنتان لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. يتم إعادة ترطيب اليرقات في سلسلة متدرجة من الميثانول وPBTS بتركيز 0.5% عبر السلاسل التالية: من 25 إلى 75، ثم 50 إلى 50، ثم 25 إلى 75، وصولاً إلى 100% PBTS، مع سحب المحلول بالماصة وإضافة محلول جديد إلى القارورة نفسها.

مليلتر واحد من المحلول لكل أنبوب. 20 دقيقة في كل محلول. يجب عدم تعريض اليرقات للهواء أبداً.

اترك دائماً كمية قليلة من المحلول لتغطية اليرقات. عند تغيير المحاليل، قم بإزالة PBT واستبداله بـ 1 mL من محلول الحجب PBS مع 1% DMSO و 0.5% إلى 10% من مصل الماعز الطبيعي لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C على جهاز هزاز. انقل اليرقات إلى 2 mL من eph.

قم بإزالة مصل الحجب واستبداله بـ 300 microliters من الجسم المضاد الأولي. استخدم monoclonal sodium potassium at TPS بتخفيف 1:25 alpha six F supernat، و 300 microliters من محلول الحضن PBS مع 1%DMSO و 0.5%tween و 2%normal goat serum طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على جهاز هزاز. قم بإزالة الجسم المضاد الأولي واغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة باستخدام 1 milliliter من محلول الحضن في درجة حرارة الغرفة، مع الوضع على جهاز هزاز أثناء كل عملية غسيل.

ثم يتم التحضين باستخدام جسم مضاد ثانوي مخفف بنسبة 1:500 في محلول التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُغسل اليرقات ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل غسلة باستخدام PBT، ثم تُجفف اليرقات من خلال سلسلة إيثانول متدرجة عن طريق النقع لمدة 10 دقائق لكل خطوة. يتم تحضير محلول الارتشاح باستخدام 25 milliliters من محلول التضمين JB four A و 0.24 grams من المحفز مع الإذابة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد.

قم بإزالة الإيثانول بتركيز 100% واستبداله بمحلول التغلغل البلاستيكي. ضع الأنابيب في درجة حرارة أربعة درجات مئوية على جهاز تدوير واترك عملية التغلغل تستمر لمدة 30 دقيقة تقريباً حتى تغوص اليرقات إلى قاع الأنبوب. ولتضمين اليرقات، ضع صينية أكواب القولبة البلاستيكية تحت مجهر تشريحي.

انقل اليرقات مع كمية كافية من محلول التسلل لتغطيتها إلى الكؤوس. يتم تحضير وسط التضمين البلاستيكي في أنبوب بلاستيكي صغير. وعادةً ما نقوم بتضمين أربع إلى خمس يرقات في المرة الواحدة باستخدام يرقة واحدة لكل كأس، مع تحضير 5 mL من البلاستيك المستخدم في التضمين.

أضف 35 µL من محلول التضمين B (JB four) لكل ملليلتر من محلول التسلل، واخلط جيداً عن طريق السحب والدفع باستخدام ماصة بلاستيكية لعدة مرات لضمان بلمرة JB four بشكل صحيح. بعد تحضير 5 mL من بلاستيك التضمين، قم بإزالة بلاستيك التسلل من العينات المستديرة باستخدام ماصة بلاستيكية. املأ الكوب ببلاستيك التضمين، ويجب أن يفيض البلاستيك خارج الكوب لضمان الالتصاق الجيد لحامل القالب بالعينة.

للكشف عن الأنابيب الكلوية في أسماك الزيبرا، تُعد المقاطع العرضية هي الأفضل لهذا الغرض. يجب تضمين اليرقات عمودياً، بحيث يكون الرأس للأسفل، وذلك باستخدام رمش اصطناعي بمقبض أو ملقط دقيق.

قم بتوجيه اليرقات رأسيًا بشكل دوري حتى يتصلب البلاستيك بما يكفي لضمان عدم تحركها من موضعها. تستغرق هذه العملية من 20 إلى 30 دقيقة تقريبًا. بعد ذلك، ضع حامل الكتل المزدوج EVH فوق الأكواب واترك الصينية في درجة حرارة 4 °C طوال الليل حتى تكتمل عملية البلمرة.

ثبّت العينة في حامل القالب الخاص بالميكروتوم، واضبط مسخن الشرائح على 45 °C. صب الماء منزوع الأيونات في دورق مخبري وضعه بالقرب من الميكروتوم قبل البدء بعملية التقطيع. تأكد من توجيه القالب بطريقة تضمن الحصول على مقاطع عرضية دقيقة ليرقات الـ larvae.

يمكن تدوير روافع ضبط رأس التوجيه للمساعدة في تحديد وضعية العينة. يتم قطع مقاطع سميكة عبر الرأس. وجّه القوالب بحيث يتم أخذ مقاطع متكافئة من العيون لكل يرقة.

عندما تظهر الزعانف الصدرية في المقاطع، تكون هذه هي نقطة بداية الأنابيب المنبطحة. من هذه النقطة، قم بقطع حوالي 32 شريحة مقطعية بسماكة 4 micron من الكتل. اجمع المقاطع باستخدام الملاقط واتركها تسقط في البيكر الذي يحتوي على الماء دون أن تلامس الملاقط الماء.

سوف يتمدد المقطع بمجرد ملامسته لسطح الماء. يمكنك الآن جمعه على شريحة؛ أدخل الشريحة في الماء بزاوية 45 درجة واقترب من المقطع بمساعدة رمش ذو مقبض بحيث يلامس حدود المقطع فقط، ثم حضّن الشرائح على مسخن شرائح حتى تجف تماماً، وصوّر المقاطع باستخدام مجهر الفلورسنت العاكس (epi fluorescent) أو المجهر البؤري (confocal microscopy).

عند تنفيذ العملية بشكل صحيح، تظهر اليرقة المحقونة كما هو موضح هنا في الصورة العلوية، حيث يتواجد الديكستران الأصفر الفلوري لوسيفيراز في الجهاز الوعائي لليرقات. أما إذا كان الحقن عميقاً جداً، كما في الصورة السفلية، فيمكن رؤية المادة المحقونة في كيس المح، أو قد يتم ثقب القلب مما يتسبب في نزيف مفرط. وقد طورت اليرقات وذمة تأمورية نتيجة للسمية الكلوية لـ gentamicin كما هو موضح هنا.

لا تظهر اليرقات الضابطة في الجزء العلوي أي وذمة تأمورية. ومع ذلك، عند حقنها بـ gentamycin، تظهر 80% من يرقات zebrafish وذمة متوسطة أو شديدة كما تشير الأسهم في اللوحتين الوسطى والسفلية. نحن نستخدم نظام تصنيف يعتمد على النمط الظاهري، حيث تظهر اليرقات ذات الوذمة المتوسطة وذمة تأمورية واضحة، ولكن دون أي أنماط ظاهرية أخرى ملحوظة.

بينما تُظهر اليرقات التي تعاني من وذمة شديدة وذمة في التأمور والجذع، وغياباً في الدورة الدموية بالجذع، وانحناءً محورياً طفيفاً إلى متوسط عند استخدام جسم مضاد للأنابيب الكلوية ضد صوديوم بوتاسيوم atpa ace. تظهر الأنابيب التالفة في المقاطع العرضية مع فقدان واضح في قطبية الخلايا في اللوحين C و D، وتمزق أنبوبي في الأنابيب التالفة مقارنة بالمجموعات الضابطة في اللوحين A و B. ويظل هذا النمط متسقاً عبر عدة مقاطع عرضية عند مقارنة المقاطع. تُستخدم الزعانف العاملة والأنابيب الملتوية القريبة كعلامات تشريحية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحفيز الإصابة الكلوية الحادة في يرقات zebrafish. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام إبر حقن بقطر يتراوح بين 10 20 micrometers. قد يكون من الضروري صقل بعض الماصات القابضة حرارياً (fire polish) من أجل الحصول على الأحجام المناسبة، ولكن بمجرد الحصول على واحدة، يمكنك الاحتفاظ بها لأنها قد تستمر لعدة جلسات حقن.

كذلك، من المهم التأكد من عدم وجود أي فقاعات هوائية في جهاز micro series JA لأن ذلك من شأنه أن يقلل من دقة تموضع النظام. وأخيراً، يتم وضع السمكة بشكل رأسي أثناء عملية الطمر من أجل الحصول على مقطع عرضي مثالي للأنابيب الكلوية. وبهذا نكون قد انتهينا.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.