متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

يتيح التعبير عن المراسلين الفلورية في الحيوانات المعدلة وراثياً تتبع الاستجابات الخلوية للتلاعبات التجريبية في نماذج الأمراض الحية. هنا، يتم تحفيز فقدان الخلايا الانتقائي دوائياً في سمك الزيبرا، مع التقاط صور بؤرية متعددة الألوان عالية الدقة للخلايا المستهدفة والجيران المباشرين لها قبل وبعد المعالجة الدوائية مباشرة، وبفواصل زمنية تالية. ويظهر تحليل الصور تفعيل مجموعات الخلايا الجذعية الداخلية وما يلي ذلك من استبدال للخلايا المستهدفة خلال مرحلة التعافي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا التجديد، مثل: ما هي الآليات الخلوية والجزيئية المستخدمة لتجديد أنواع خلوية منفصلة؟ ابدأ بنقل البيوض المعدلة وراثياً والمجمعة من عمليات التزاوج إلى طبق بتري يحتوي على محلول danio بتركيز 0.3 في الساعة 16 بعد الإخصاب. أضف PTU لتثبيط نشاط tyrosine ACE قبل ظهور أي دليل على التصبغ في النسيج المستهدف. إذا لم يكن الجنين مهقاً، قم بتحضين الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C.

بمجرد ظهور البروتينات المراسلة، ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو زووم فلوري وقم بفرز الأجنة بناءً على التعبير الجيني المطلوب للجين المنقول. قبل التصوير، قم بتحضير محلول تثبيت aeros منخفض الانصهار بتركيز 0.5% في وسط أجنة، واحفظه عند درجة حرارة 40 degrees Celsius.

أضف trica وPTU إذا لزم الأمر. اخلط المزيج برفق وأعده إلى 40 درجة Celsius. خدر الأسماك بوضعها في وسط أجنة يحتوي على trica.

ستصبح الأسماك غير مستجيبة لمدة ثلاث دقائق تقريباً. ولنقل السمكة باستخدام ماصة دقيقة، اسحب كل سمكة على حدة إلى طرف ماصة مقصوص في حجم يبلغ حوالي 30 microliters من المحلول المخدر. بعد ذلك، اقلب الماصة واترك السمكة تستقر في القاع.

لامس الطرف بمحلول التثبيت واتركه ينتقل بفعل الجاذبية. احرص على عدم تخفيف المادة المخدرة لضمان إمكانية إعادة استخدامها. تخلص من محلول التخدير المتبقي في الماصة الدقيقة.

بعد ذلك وباستخدام نفس الطرف، انقل السمكة إلى طبق بتري. وفي حوالي 30 µL من محلول التثبيت، وجه السمكة برفق بحيث تكون المنطقة المراد دراستها متمركزة في قطرة الـ aeros. تأكد من بقاء السمكة في الوضعية المطلوبة حتى يتصلب الـ aeros.

يمكن تثبيت عدة أسماك في طبق بتري واحد إذا رغبت في ذلك. بعد تصلب مادة الأيروس، انقل الأسماك إلى منصة المجهر البؤري وأضف بلطف وسط أجنة يحتوي على trica مع أو بدون PTU إلى الطبق حتى تغمر الأسماك تماماً. افتح برنامج التصوير وقم بضبط التركيز على المنطقة المراد دراستها للحصول على أفضل تصوير للتفاصيل الخلوية و/أو الجزيئية.

استخدم عدسات شيئية ذات مسافة عمل طويلة وفتحات عددية عالية في البرنامج. اختر فلتر الفلورسنت المناسب من القائمة المنسدلة. انقر فوق إعدادات الطيف وأجرِ التعديلات اللازمة على نطاقات الانبعاث.

للحصول على فصل نقي لإشارات المراسل ولرفع نسبة الإشارة إلى الضجيج إلى أقصى حد. اختر العدسة الشيئية المناسبة من القائمة المنسدلة لضمان ضبط الإعدادات المسبقة المحددة في البرنامج بشكل صحيح. ولتركيز أشعة الليزر وتحديد مستويات الطاقة، اختر مخرجاً من جدول البحث يُظهر تشبع البكسل لكل قناة.

بعد ذلك، اضبط حساسية الكاشف للحصول على جودة الصورة المطلوبة، وارفع قدرة الليزر تدريجياً حتى تصبح كثافة الصورة مقبولة. تجنب تشبع البكسلات في المنطقة المستهدفة وحافظ على مستويات الليزر في أدنى حد ممكن، وذلك لتقليل مشكلات التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

تحقق من أن كل خط ليزر ينتج إشارة يمكن اكتشافها في القناة المناسبة فقط عن طريق تشغيل وإيقاف تشغيل الليزرات يدويًا مع مراقبة جميع قنوات التصوير. إذا لم يكن هناك تداخل ظاهري، يمكن الحصول على جميع القنوات في وقت واحد. بعد ذلك، قم بتأطير المنطقة ذات الاهتمام باستخدام وظائف التكبير والتدوير.

بعد ذلك، يتم ضبط سرعة المسح وحجم الصورة؛ حيث تؤدي سرعات المسح الأسرع إلى تقليل زمن بقاء الليزر وزيادة الدقة الزمنية. يتم ضبط حجم خطوة البعد Z وفقًا للاحتياجات التجريبية. في هذه التجربة، تم استخدام حجم خطوة قدره 10 microns لتصوير سبعة مقاطع بصرية لنسيج الشبكية.

بمجرد تحديد الإعدادات المناسبة، قم بالتقاط صور Zack واحفظها. ثم انتقل إلى السمكة التالية. يمكن إجراء تصوير متسلسل بطريقة الصيد والإطلاق لتتبع التغيرات الخلوية على مدار أيام متتالية وفقاً للتعليمات الواردة في المستند المكتوب المرفق.

عند إجراء تجربة تصوير متعددة المراسلين، يفضل استخدام فلوروفورات متباعدة طيفياً بشكل جيد، ومع ذلك، فإن هذا ليس عملياً دائماً. نعرض هنا طريقة بسيطة لطرح الصور باستخدام برنامج ImageJ مفتوح المصدر لفصل الفلوروفورات ذات ملفات الإثارة والانبعاث المتداخلة، وفي حالتنا هذه، GFP و YFP.

استُخدمت تقنيات التصوير الزمني الموصوفة في هذا الفيديو لمراقبة الخلايا الجذعية الشبكية الموُسمة بـ GFP أثناء استئصال وتجديد العصبونات ثنائية القطب في الشبكية. ولإجراء الفصل الطيفي، يتم جمع الصور باستخدام أنماط التصوير المتسلسل وإعدادات مرشح الحاجز المتغيرة، مما يسمح بالحصول على الفلورسنتات المتداخلة بشكل مستقل وبفصل جزئي على التوالي. وبمجرد الحصول على الصور، استخدم أداة استيراد loci bio formas في برنامج ImageJ لفتح ملفات الصور وبدء أداة الاستيراد. ثم اسحب الملف المطلوب إلى نافذة ImageJ.

قم بتقسيم القنوات إلى مجموعات صور فردية باستخدام خانة اختيار "split channels" في نافذة الاستيراد لبدء تشغيل ملحق "align three TP". انقر فوق plugins، ثم align stacks، ثم align three tp.

يجب محاذاة المجموعات لضمان إجراء عملية الطرح بشكل صحيح. اختر المجموعة المرجعية من مربع القائمة المنسدلة الأول والمجموعة غير المحاذية من القائمة الثانية. حدد المربعين "use XY relative origin" و"use Z relative origin" ثم انقر موافق.

لبدء عملية المحاذاة، انقر فوق زر تسجيل الحجم (volume registration). ستظهر نافذة جديدة تحتوي على معلمات المحاذاة. انقر فوق موافق.

تم تحسين هذا القسم بواسطة موزع المكون الإضافي، لذا لا داعي لإجراء أي تعديلات. عند الانتهاء، ستظهر نافذة المجموعات المحاذات. اختر المخرجات من النافذة المحاذات لفتح نافذة المخرجات.

هذه النافذة مُحسَّنة أيضاً ولا تحتاج إلى أي تعديل. انقر موافق. ستظهر مجموعة صور جديدة في مساحة العمل مع إضافة كلمة aligned إلى نهاية عنوان الملف.

لإزالة التداخل (crosstalk) باستخدام حاسبة الصور (image calculator)، انقر على process ثم image calculator. اختر المجموعة (stack) المراد طرح القيم منها من القائمة المنسدلة image one والمجموعة التي ستُستخدم في عملية الطرح. من القائمة المنسدلة image two، اختر subtract من قائمة العمليات (operation) ثم انقر على okay.

سيطلب برنامج Image J معالجة مجموعة الصور (stack). اختر "نعم". ستظهر مجموعة صور جديدة تم فيها إزالة التداخل (crosstalk) بين القنوات المتداخلة.

قم بدمج المجموعات لإعادة إنشاء نفس بنية الصورة قبل عملية المحاذاة والطرح. من خلال تحديد القنوات المدمجة في نافذة أدوات القنوات، تتيح الأداة دمج ما يصل إلى أربع مجموعات في مجموعة فائقة (hyper stack). وأخيرًا، قم بتلوين القنوات وضبط السطوع والتباين، ثم احفظ الملفات بصيغة tiffs لفحص فقدان وتجدد nitro reductase المستهدف.

خلايا ثنائية القطب في الشبكية تعبر عن M cherry. تم التقاط سلسلة زمنية من الصور البؤرية في أسماك zebrafish فردية قبل المعالجة. يظهر تعبير فسيفسائي لمراسل YFP المرتبط بالغشاء في الخلايا ثنائية القطب الضابطة باللون الأصفر، وبروتين nitro reductase المدمج مع cherry في الخلايا ثنائية القطب المستهدفة باللون الأحمر.

يوفر الجين المنقول CFP المرتبط بالغشاء والموضح باللون السماوي معلومات سياقية عن معظم خلايا الشبكية الأخرى لمزيد من الوضوح. وتظهر الصورة نفسها بدون إشارة CFP بعد المعالجة بـ metronidazole. حيث تُفقد الخلايا ثنائية القطب المعبرة عن nitro reductase الملونة باللون الأحمر، بينما تنجو الخلايا ثنائية القطب الضابطة الملونة باللون الأصفر.

يوضح هذا الطبيعة عالية التحديد لمنهجية الاستئصال هذه. ومرة أخرى، يتم عرض الصورة نفسها بدون CFP من أجل الوضوح. وعند إزالة metro NIAZ، تعود الخلايا التي تعبر عن NTR هنا.

يوضح هذا الشكل مثالاً على طريقة طرح G-F-P-Y-F-P في خلايا Mueller الموسومة بـ GFP. تظهر خلايا GL باللون الأخضر وتظهر الخلايا ثنائية القطب الموسومة بـ YFP باللون الأرجواني. وينتج عن التداخل بين الاثنين اللون الأبيض لإجراء عملية الطرح.

يجب أولاً محاذاة صور GFP وYFP. تسمح عملية الطرح بعد ذلك بإزالة الخلايا ثنائية القطب المسمى بـ YFP من صورة GFP، مما يتيح تمثيلاً واضحاً لخلايا Mueller المسمى بـ GFP والكشف عن خلايا Mueller الأكثر خفوتاً. يمكن الآن التحقق من التداخل بين خلايا Mueller الخافتة والخلايا ثنائية القطب المسمى بـ M cherry والموضحة باللون الأحمر.

تشير البيانات المعروضة هنا إلى أن استئصال الخلايا ثنائية القطب يحفز خلايا mullar ggl لتعويض الخلايا المفقودة. ويتوافق هذا التفسير مع الدراسات الحديثة حول تجدد الشبكية، والتي تشير إلى أن خلايا Mueller Ggl تعمل كخلايا سلفية محفزة بالإصابة في كل من الثدييات والأسماك. تتيح هذه التقنية للباحثين استكشاف الآليات التي تنظم تجدد أنواع محددة من الخلايا من خلال تصور الخلايا الجذعية في zebrafish.