متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

يتيح التعبير عن مراسلي الفلورسنت في المعدلة وراثيا متابعة الاستجابات الخلوية للتلاعب التجريبي في نماذج الأمراض الحية. هنا ، يتم تحفيز فقدان الخلايا الانتقائي دوائيا في أسماك الحمار الوحشي ، كونفوكال متعدد الألوان عالي الدقة. يتم الحصول على صور الخلايا المستهدفة والجيران المباشرين قبل ذلك مباشرة ، وتظهر فواصل زمنية متباعدة بعد تحليل صورة العلاج بالعقاقير تنشيط مجموعات الخلايا الجذعية الذاتية والاستبدال اللاحق للخلايا المستهدفة خلال مرحلة التعافي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء المتجدد ، مثل ما هي الآليات الخلوية والجزيئية المستخدمة لتجديد أنواع الخلايا السرية ابدأ بنقل البويضات المعدلة وراثيا التي تم جمعها من التزاوج إلى طبق بتري يحتوي على 0.3 × محلول دانيو في 16 ساعة بعد الإخصاب. أضف PTU لتثبيط نشاط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين قبل أي دليل على تصبغ الأنسجة ذات الاهتمام. إذا لم يكن الجنين ألبينو ، فقم باحتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية.

بمجرد أن يصبح المراسلون واضحين ، ضع طبق بتري تحت مجهر تكبير استريو فلوري وفرز التعبير المطلوب من الجينات المعدلة وراثيا. قبل التصوير. قم بإعداد محلول تركيب هوائي منخفض الذوبان بنسبة 0.5٪ في وسط الجنين وتخزينه عند 40 درجة مئوية.

أضف trica و PTU إذا لزم الأمر. تخلط بلطف وتعاد إلى 40 درجة مئوية. تخدير الأسماك عن طريق وضعها في وسط جنين يحتوي على تريكا.

لمدة ثلاث دقائق تقريبا ، ستصبح الأسماك غير مستجيبة. للمس باستخدام ماصة دقيقة، اسحب سمكة فردية إلى طرف ماصة مشذب بحجم 30 ميكرولترا تقريبا من محلول التخدير. بعد ذلك ، اقلب الماصة واترك السمكة تستقر في القاع.

المس طرف محلول التثبيت واسمح لهم بالانتقال عن طريق الجاذبية. احرص على عدم تخفيف الغرو حتى يمكن إعادة استخدامه. تخلص من محلول التخدير المتبقي من الماصة الدقيقة.

ثم باستخدام نفس الطرف ، انقل السمك إلى طبق بتري. في حوالي 30 ميكرولتر من محلول التركيب ، قم بتوجيه الأسماك برفق بحيث تتركز منطقة الاهتمام في قطرة الهواء. تأكد من بقاء السمكة في الاتجاه المطلوب حتى تصلب الأيروس.

يمكن تركيب أسماك متعددة في طبق بتري واحد إذا رغبت في ذلك. بعد أن تصلب الأيروس ، انقل السمكة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر وأضف وسط الجنين الذي يحتوي برفق على trica زائد أو ناقص PTU إلى الطبق حتى تغمر الأسماك تماما. افتح برنامج التصوير وركز على المنطقة ذات الاهتمام للحصول على التصوير الأمثل للتفاصيل الخلوية و / أو الجزيئية.

استخدم أهداف مسافة العمل الطويلة ذات الفتحات العددية العالية في البرنامج. اختر أربعة النباتات المناسبة من قائمة الاتصالات. انقر فوق الإعداد الطيفي وقم بإجراء تعديلات على نطاقات الإرسال.

للحصول على فصل نظيف لإشارات المراسل وتعظيم نسب الإشارة إلى الضوضاء. حدد الهدف المناسب في القائمة المنسدلة للتأكد من ضبط أي إعدادات مسبقة محددة بالبرامج بشكل صحيح. لتركيز الليزر وتعيين مستويات الطاقة، حدد مخرجا من جدول البحث يكشف عن تشبع البكسل لكل قناة.

بعد ذلك ، اضبط حساسية الكاشف للحصول على جودة الصورة المطلوبة ، وارفع إخراج الليزر تدريجيا حتى تصبح شدة الصورة مقبولة. تجنب تشبع البكسل في المنطقة المعنية وحافظ على مستويات الليزر منخفضة قدر الإمكان. لتقليل مشاكل التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

تأكد من أن كل خط ليزر ينتج إشارة يمكن اكتشافها فقط في القناة المناسبة عن طريق تشغيل الليزر وإيقاف تشغيله يدويا أثناء مراقبة جميع قنوات التصوير. إذا لم يكن الحديث المتبادل واضحا ، فيمكن الحصول على جميع القنوات في وقت واحد. بعد ذلك ، قم بتأطير مجال الاهتمام باستخدام وظائف التكبير / التصغير والتدوير.

ثم اضبط سرعة المسح وحجم الصورة باستخدام سرعات مسح أعلى ، ويقلل من وقت السكون بالليزر ويزيد من الدقة الزمنية. اضبط حجم خطوة البعد Z وفقا للاحتياجات التجريبية. هنا يتم استخدام حجم خطوة يبلغ 10 ميكرون لتصوير سبعة أقسام بصرية من أنسجة الشبكية.

بمجرد تحديد الإعدادات المناسبة ، احصل على صور Zack واحفظها. ثم انتقل إلى السمكة التالية. يمكن إجراء التصوير التسلسلي للالتقاط والإفراج لتتبع التغيرات الخلوية على مدار أيام متتالية وفقا للتعليمات الواردة في المستند المكتوب المصاحب.

عند إجراء تجربة تصوير متعدد المراسلين ، من الأفضل استخدام أرضيات أرضية مفصولة جيدا ، طيفية ، ومع ذلك ، فهذا ليس عمليا دائما. نعرض هنا طريقة بسيطة لطرح الصورة باستخدام صورة البرنامج مفتوح المصدر J لفصل أرضيات الأرضية مع ملفات تعريف الإثارة والانبعاث المتداخلة. في حالتنا ، GFP و YFP.

استخدام تقنيات التصوير الزمنية الموضحة في هذا الفيديو لمراقبة الخلايا الجذعية الشبكية المسماة GFP أثناء استئصال وتجديد الخلايا العصبية ثنائية القطب في الشبكية لإجراء الفصل الطيفي ، اجمع الصور باستخدام أوضاع التصوير المتسلسلة وإعدادات مرشح الحاجز المتغير ، والتي تسمح بالحصول على الأرضية الرابعة المتداخلة بشكل مستقل ومنفصل جزئيا على التوالي. بمجرد الحصول على الصور ، استخدم استيراد ImageJ loci bio formas لفتح ملفات الصور لبدء أداة الاستيراد. اسحب الملف محل الاهتمام إلى نافذة الصورة J.

قم بتقسيم القنوات إلى مكدسات فردية باستخدام خانة اختيار تقسيم القنوات في نافذة الاستيراد لبدء المكون الإضافي لمحاذاة ثلاثة TP. انقر فوق المكونات الإضافية ، ثم قم بمحاذاة المكدسات. ثم قم بمحاذاة ثلاثة tp.

يجب محاذاة الأكوام لضمان الطرح المناسب. حدد المكدس المرجعي في المربع المنسدل الأول والمكدس غير المحاذاة في الثانية. حدد استخدام الأصل النسبي XY واستخدم مربعات الأصل النسبي Z وانقر فوق موافق.

لبدء عملية المحاذاة ، انقر فوق الزر تسجيل وحدة التخزين. ستظهر نافذة جديدة تحتوي على معلمات المحاذاة. انقر فوق موافق.

تم تحسين هذا القسم من قبل موزع المكون الإضافي ، لذلك لا يلزم إجراء تعديلات. عند الانتهاء، ستظهر نافذة مكدسات محاذاة. حدد الإخراج من النافذة المحاذاة لفتح نافذة الإخراج.

تم تحسين هذه النافذة أيضا ولا تحتاج إلى تعديل. انقر فوق موافق. سيظهر مكدس جديد في مساحة العمل مع محاذاة ملحقة بنهاية عنوان الملف.

لإزالة الحديث المتبادل باستخدام حاسبة الصور ، انقر فوق عملية ثم حاسبة الصورة. حدد المكدس المراد طرحه في الصورة مربع القائمة المنسدلة واحد والمكدس المراد استخدامه في الطرح. في المربع المنسدل للصورة الثانية ، حدد طرح في مربع القائمة المنسدلة للعملية وانقر فوق موافق.

ستطلب الصورة J معالجة المكدس. حدد نعم. يجب أن تظهر مكدس جديد ، مما أدى إلى إزالة الحديث المتبادل بين القنوات المتداخلة.

ادمج المكدسات لإعادة إنشاء نفس بنية الصورة قبل المحاذاة والطرح. من خلال تحديد القنوات المدمجة في نافذة أدوات القناة ، تسمح الأداة بدمج ما يصل إلى أربعة مكدسات في مكدس فائق. أخيرا ، قم بتلوين القنوات واضبطها للسطوع والتباين واحفظ الملفات كمحافل لفحص الخسارة المستهدفة وتجديد اختزال النيترو.

M الكرز الذي يعبر عن الخلايا ثنائية القطب في الشبكية. تم التقاط سلسلة زمنية من الصور متحدة البؤر في أسماك الزرد الفردية قبل العلاج. يوجد تعبير فسيفسائي للغشاء الموسوم بمراسل YFP في الخلايا ثنائية القطب الخاضعة للرصدع الموضح ببروتين اندماج الكرز الأصفر واختزال النيترو في ثنائي القطب المستهدف الموضح باللون الأحمر.

يوفر الغشاء الموسوم بالجين المعدل CFP الموضح باللون السماوي معلومات سياقية حول معظم خلايا الشبكية الأخرى لمزيد من الوضوح. تظهر نفس الصورة بدون إشارة CFP بعد العلاج بميترونيدازول. يتم فقدان اختزال النيترو الأحمر الذي يعبر عن الخلايا ثنائية القطب بينما يتم إنقاذ الخلايا ثنائية القطب التي يتم التحكم فيها باللون الأصفر.

يوضح هذا الطبيعة المحددة للغاية لمنهجية الاستئصال هذه. مرة أخرى ، يتم عرض نفس الصورة بدون CFP من أجل الوضوح. عند إزالة metro NIAZ ، تعود الخلايا التي تعبر عن NTR هنا.

مثال على طريقة الطرح G-F-P-Y-F-P في هذا الشكل GFP المسمى Mueller. تظهر خلايا GL باللون الأخضر وتظهر الخلايا ثنائية القطب المسماة YFP باللون الأرجواني. ينتج عن التداخل بين الاثنين اللون الأبيض لأداء الطرح.

يجب أولا محاذاة صور GFP و YFP. تسمح عملية الطرح بعد ذلك بإزالة الخلايا ثنائية القطب المسماة YFP من صورة GFP ، مما يسمح بتمثيل GFP المسمى Mueller ggl بشكل نظيف واكتشاف خلايا مولر باهتة. يمكن الآن التحقق من التداخل بين الخلايا ثنائية القطب المعتمة Mueller و ggl و M الكرز الموضحة باللون الأحمر.

البيانات الموضحة هنا إلى أن استئصال الخلايا ثنائية القطب يؤدي إلى mullar ggl لاستبدال الخلايا المفقودة. يتماشى هذا التفسير مع الدراسات الحديثة لتجديد الشبكية ، والتي تورط Mueller Ggl على أنه أسلاف ناتجة عن الإصابة في كل من الثدييات والأسماك. تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف الآليات التي تنظم تجديد أنواع معينة من الخلايا من خلال تصور الخلايا الجذعية في أسماك الزرد.