أكتوبر 15, 2010
يناقش هذا البروتوكول تشريح حية ذبابة الفاكهة اليرقات لغرض التصوير حركة الحويصلات GFP محواري الموسومة على المسارات أنيبيب.
لدراسة ما إذا كانت هناك عيوب في النقل المحوري بعيد المدى في الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أو مرض هنتنغتون. يتم تصوير النقل المحوري للحويصلات الناقلة في يرقات المريء الحية. يتم البحث هنا.
يتم تشريح اليرقات النجمية الثالثة التي تعبر عن بروتين فيزيائي موسوم بـ A GFP على مكعب هلامي، ثم تُنقل إلى المجهر للتصوير الحي. بعد ذلك، يُستخدم المجهر الفلوري لتتبع النقل الفيزيائي داخل المحور العصبي. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في تصور الحركة الحية وغير المنقطعة للحويصلات التشابكية والمحاور العصبية لليرقات.
استعد لعملية التشريح من خلال التأكد من توفر المستلزمات والكواشف التالية. محلول التشريح المنظم. مكعب من مادة Sill guard مقصوص بعرض بوصة واحدة، وطول بوصة واحدة، وارتفاع سنتيمتر واحد، وموضوع على شريحة زجاجية.
دبابيس تشريح قصيرة جداً. الجزء السفلي الحاد من دبابيس manum هو الأكثر فعالية في عمليات التشريح. ويمكن الحصول على الطول المناسب عن طريق إدخال دبابيس أطول في الهلام ثم قص أي جزء بارز من الدبوس.
ستحتاج أيضاً إلى زوج واحد من مقصات التشريح الدقيق الحادة، ومجموعتين من الملاقط دقيقة الطرف. استخدم ملعقة معدنية صغيرة لنقل يرقات المرحلة الثالثة من نجم البحر التي تعبر عن بروتين SLE الموسوم بـ GFP إلى طبق بتري.
بعد ذلك، أضف الماء منزوع الأيونات إلى اليرقات في طبق بتري للتخلص من جميع بقايا الطعام. ثم باستخدام الملقط، انقلها إلى مكعب جل التشريح لإجراء التشريح الحي. استخدم الملقط لنقل اليرقة إلى مكعب جل التشريح.
أضف محلول التشريح إلى شريحة زجاجية لغمرها. بعد ذلك، ثبّت اليرقة بدبابيس عند الطرفين الأمامي والخلفي بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. وباستخدام مقصات التشريح الدقيق، قم بإجراء قطع صغير عند الخط المتوسط بالقرب من الطرف الخلفي.
من هذا الشق، قم بإجراء قطع آخر وصولاً إلى الجهة الأمامية. ستندفع الأمعاء والأجسام الدهنية للخارج، لذا استخدم دبوسين لتثبيت حواف الكيوتيكل المقطوعة على الجوانب في مكعب تثبيت العينة.
استخدم ماصة لإضافة قطرة من محلول التشريح المنظم. ثم استخدم الملاقط لإزالة الأمعاء والأجسام الدهنية بعناية. ضع منديلاً ورقياً (kim wipe) على أحد جانبي اليرقة لإزالة المحلول المنظم، مع إضافة محلول تشريح منظم جديد في الوقت ذاته باستخدام الماصة.
يجب ألا تجف الحمم مطلقاً. ولوسم البنى الميتوكوندرية أو الليزوزومية في الحمم، استبدل محلول التشريح بمحلول تشريح يحتوي على mito tracker أو lyo tracker. ضع مكعب التشريح في غرفة رطبة مربعة وغطِّه بورق الألومنيوم.
يُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تحضين الواسم الحي (in vivo marker)، يتم امتصاص محلول التشريح المحيط باليرقات بشكل متكرر وإضافة المزيد من محلول التشريح باستخدام ماصة. تكرر هذه العملية خمس مرات لغسل أي بقايا من الواسم.
بعد استبدال الغسلة الأخيرة، ادفع الدبابيس بالكامل داخل واقي S وضع غطاء شريحة على الفور لمنع حركة اليرقة. أصبحت اليرقة الآن جاهزة للفحص. لإجراء التصوير الحي لليرقة المُشرحة، ضع العينة على منصة مجهر مقلوب لتصوير الحويصلات المأشّرة.
داخل الأعصاب القطعية لليرقة. يتم إجراء التصوير باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 100 مرة. في حال ملاحظة صبغ GFP قوي في أجسام الخلايا في صورة العقدة البطنية، يمكن عرض بروتينين موسومين في الجسم الحي في آن واحد في الأعصاب القطعية باستخدام نظام رؤية مزدوج مع مرشحات لـ C-F-P-Y-F-P أو R-F-P-Y-F-P وبرنامج عرض منقسم.
تظهر في هذه السلسلة من التصوير بالفاصل الزمني العديد من الحويصلات المحورية على مسارات محورية متعددة داخل عصب قطعي يرقائي. لاحظ أن GFP يمثل التراكمات المحورية، كما لاحظ الحركة ثنائية الاتجاه للحويصلات. تظهر هنا حركة الحويصلات المحورية على مسار واحد داخل عصب قطعي يرقائي.
لاحظ أن الحركة ثنائية الاتجاه لهذه السياليات تبلغ في المتوسط ميكرون واحد في الثانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إتمام عملية تشريح نظيفة للمعاينة الحية للحويصلات الملحقة بـ GFP والمحاور العصبية ليرقات gsof.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يناقش هذا البروتوكول عملية التشريح الحي ليرقات Drosophila لتصوير حركة الحويصلات المحورية الموسومة ببروتين GFP على مسارات الأنابيب الدقيقة. وتسمح هذه التقنية بتصور الحركة الحية وغير المنقطعة للحويصلات المشبكية داخل المحاور العصبية لليرقات.
يعد فهم ديناميكيات النقل المحوري أمراً بالغ الأهمية لتقليل المخاطر المرتبطة بأهداف الأمراض التنكسية العصبية، حيث ترتبط العيوب في نقل الحويصلات آلياً بمرض الزهايمر، ومرض هنتنغتون، والتصلب الجانبي الضموري (ALS). يتيح نموذج المحور العصبي ليرقات Drosophila هذا التصوير المباشر لحركة الحويصلات التشابكية، مما يوفر نظاماً تنبؤياً ذا صلة بالمرض للتحقق المبكر من الأهداف واكتساب رؤى ميكانيكية. ومن خلال قياس تدفق الحويصلات ثنائي الاتجاه ومعدلات النقل، تدعم هذه الطريقة قرارات المتابعة أو الإيقاف في البرامج قبل السريرية التي تركز على سلامة المحور العصبي.
تندرج هذه الطريقة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يدعم اختبار الفرضيات في مرحلة الاكتشاف المبكرة، وجاهزية المقايسة في عملية الفرز، والتحقق الميكانيكي في المراحل قبل السريرية.