حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

كل 15 ثانية، يوجد طفل يموت بسبب الملاريا في العالم، وهنا في مختبر جيمس، نحاول استنباط بعوض فرنسي لا يمكنه حمل طفيليات الملاريا. اسمي TIUs، وأنا هنا في جامعة كاليفورنيا إيرفاين في قسم البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية في مختبر أنتوني جيمس.

سأوضح لكم اليوم كيفية إنتاج بعوض معدل وراثياً وغير معدل وراثياً. ونقوم بذلك لجعل البعوض الناقل للملاريا مقاومًا، بحيث لا يمكنه حمل طفيلي الملاريا. لقد قمت الآن بتجهيز قارورة تحتوي على محلول منظم متساوي التوتر حيث سيضع البعوض بيوضه.

سأستخدم جهاز الشفط هذا لسحب البعوض ووضعه في أنبوبة. ثم توضع هذه الأنبوبة في حاضنة عند درجة حرارة 30 °C، وسنتركها لمدة ساعة تقريبًا داخل كوب. الآن سنقوم بسحب إبر الحقن المجهري.

هذه إبر مصنوعة من الكوارتز، ويتعين علينا استخدام طرف دقيق للغاية؛ لذا، نحتاج إلى جهاز سحب الإبر هذا. نحن نستخدم جهاز سحب إبر من شركة Suter Instruments، كما نستخدم الإبر من شركة Suter Instruments أيضاً.

الآن، نقوم بإخراج البعوض وسأضع هذه البيوض في طبق بتري يحتوي على ورقة ترشيح مشبعة بمحلول منظم متساوي التوتر (isotonic buffer)، وذلك للحفاظ على رطوبة الأجنة خلال فترة الحقن. إن كمية الماء الموجودة على ورقة الترشيح أمر بالغ الأهمية؛ إذ يجب ألا تطفو البيوض ولا أن تجف الورقة.

سأقوم الآن بنقل الجنين من ورقة البيض إلى ورقة واتمان أخرى بمقاس 3 ملم تكون قد غمرت في محلول منظم متساوي التوتر. أقوم بذلك لإزالة الغشاء الكوريوني قبل محاذاتهم لعملية الحقن المجهري. والآن سأقوم بإزالة الغشاء الكوريوني، وهو هذا السطح الفضي الموجود على البيض.

وأقوم بذلك عن طريق إزالتها باستخدام الفرشاة. لذا لدينا هنا في الأعلى جنين لا يزال يغطيه الغشاء الكوريوني، وبهذا الجزء الفضي اللامع. فأين هو الجنين الذي بالأسفل؟

لقد نجحت في إزالة الكوريان، ومن المرجح أن الجزء العلوي سينزلق على الشريط، بينما سيلتصق الجزء السفلي. وهذا هو الأمر المهم عند التعامل مع جانب غير متساوٍ. والآن أقوم بمحاذاة الأجنة.

تكون الأجنة أكثر سمكاً عند الطرف الأمامي، وهو الطرف الذي أضعه جهة اليمين. أما جهة اليسار فيوجد الطرف الخلفي، وهو الأكثر نحافة، ومن هنا سأقوم بحقن الأجنة. أحاول وضعها معاً بحيث تدعم بعضها البعض للبقاء في موضعها.

وعادةً ما أقوم بوضع حوالي 10 منها في صف واحد. الآن لدي صف من الأجنة، وسأقوم بنقلها إلى شريحة غطاء. على شريحة الغطاء.

لقد وضعت شريطاً لاصقاً للشعر لضمان تثبيتها. وعند الانتهاء من ذلك، سأقوم بتجفيف ورقة الترشيح التي تستقر عليها الأجنة باستخدام ورقة ترشيح أخرى، ثم أضع الأجنة على غطاء الشريحة وأتركها تجف لمدة 30 ثانية قبل إضافة الزيت. والآن، قمنا بمحاذاة الأجنة وتغطيتها بالزيت.

على منصة المجهر، سنقوم بحقن DNA ممزوج بصبغة غذائية باستخدام هذا الطرف الخاص بنمط الميكروب، وحقنه في إبر المنفذ. الآن، قمنا بملء الإبرة وأعدناها إلى المحقن الدقيق. ونحن الآن مستعدون لإجراء عمليات الحقن الدقيق.

سأقوم الآن بتحريك الإبرة لضبط دقة التركيز حتى أتمكن من رؤيتها بوضوح. وبمجرد الانتهاء من ذلك، سأقوم بتحريك إبرة الوزن، ثم أنقل الأجنة وأقوم بضبط تركيزها أيضاً. وعندما يتم ذلك، سأحرك الإبرة مرة أخرى حتى تصل إلى الموضع المطلوب، ثم أنتقل إلى الأجنة.

الآن، عندما تخترق الإبرة الزيت، تصبح الرؤية ضبابية وتحتاج إلى ضبطها مرة أخرى. وهذا هو بالضبط ما يحدث في قراد القرش. بالضبط، قراد القرش.

والآن أنا مستعدة لإجراء عمليات الحقن. يمكنكم رؤية أنني لمست الجنين بالإبرة، ومن خلال القيام بذلك قمت بكسر الطرف ويمكنكم رؤية قطرة صغيرة تخرج وهي التي سيتم حقنها في الجنين. الآن أقوم بالحقن ثم سحب الإبرة مرة أخرى.

وأقوم بالتحقق في كل مرة بين كل جنين وآخر من وجود قطرة صغيرة تخرج عند طرف الإبرة. وكما ترون، أحتاج إلى إعادة الضبط لكل جنين للوصول إلى الموضع المثالي. أما هذا الجنين فقد كان هناك تسريب.

كما تلاحظون، عندما أقوم بالحقن الثاني في الزيت، تصبح الفقاعة كبيرة جداً وأحتاج إلى إعادة ضبط ضغط المحقن المجهري. لقد انتهينا الآن من عمليات الحقن المجهري، وسنقوم بنقل الأجنة من المجهر إلى طبق بتري الذي ملأناه بالمحلول المنظم متساوي التوتر. سأقوم بمسح الزيت من شريحة التغطية وقصها إلى قطعة صغيرة، ثم أضعها في طبق بتري.

سنتركهم الآن هنا حتى نهاية اليوم في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك، سننقلهم إلى غرفة الحشرات. لقد أوضحت لكم اليوم كيفية حقن مادة GFP لصنع بعوض عابر.

والآن، يتعين علينا فقط الانتظار حتى تفقس اليرقات، جميع اليرقات. وسنقوم بتربيتها حتى تصل إلى مرحلة البلوغ ومن ثم ستتزاوج. وبعد ذلك، سيكون أمامنا ثلاث أسابيع قبل أن نتمكن من بدء الفحص لتحديد ما إذا كانت Refactor أم لا.