Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

كانت الفئران المعدلة وراثياً لمستقبلات الخلايا التائية النوعية للمستضد لا غنى عنها في دراسة تطور ووظيفة الخلايا التائية، وذلك لإنتاج نماذج فئران ذات خصوصيات محددة مسبقاً لمستقبلات الخلايا التائية باستخدام نقل نوى الخلايا الجسدية أو SCNT. يتم إصابة الفأر بمسبب مرض معين، ثم تُعزل الخلايا التائية من الفأر ويتم تنقيتها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

تُستخدم الخلايا التائية المنقاة بعد ذلك في عملية نقل نوى الخلايا الجسدية. وعندما تصل الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأرومية، يتم عزل الخلايا الجذعية الجنينية. ثم تُحقن هذه الخلايا في أكياس أرومية، والتي تُنقل بدورها إلى فئران حامل كاذبة.

تظهر الجراء الناتجة زيادة ملحوظة في تعداد الخلايا التائية المستهدفة، والتي يمكن التحقق منها عن طريق تحليل PAX. مرحباً، اسمي Okta AK وأنا باحثة ما بعد الدكتوراه هنا في معهد White للأبحاث الطبية الحيوية. سأوضح لكم اليوم كيفية إجراء حقن المساعدة على الانفجار لنقل الخلايا الجذعية الجسدية، بالإضافة إلى نقل الأجنة.

تتمثل الميزة الرئيسية للنقل الجسدي في إمكانية إنشاء نماذج فئران تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية من الموقع الداخلي، وبالتالي تكون تحت تحكم المحفز الداخلي، بالإضافة إلى إمكانية إنشاء هذه النماذج بسرعة كبيرة. يمكن استخدام النقل السائل الجسدي كأداة لإنشاء نماذج فئران ذات خصوصيات محددة مسبقاً لمستقبلات الخلايا التائية أو مستقبلات الخلايا البائية. وهذا الأمر يكتسب أهمية خاصة للباحثين العاملين في مجالات مثل المناعة الذاتية، والأمراض المعدية، والسرطان.

لعزل الخلايا التائية النوعية لممرض مثل Toxoplasma Gandhi، يتم حقن الفأر داخل الصفاق في ذروة الاستجابة المناعية، ثم يُعزل الطحال من الفأر الذي تم إخضاعه للقتل الرحيم، وتُعزل الخلايا المانحة المتجانسة ثم تُحضن مع أجسام مضادة مُوسومة فلورياً والرباعي (tetramer) المناسب. وفي النهاية، يتم إجراء فرز الخلايا للحصول على الخلايا التائية النوعية للممرض. في المساء الذي يسبق إجراء استئصال نواة البويضة.

قم بتحضير إبر حقن piso بمقاسات 4 و5 و7 ميكرومتر باستخدام محقنة لتحميلها بالزئبق عن طريق التدفق الارتجاعي. وفي اليوم التالي، ابدأ بروتوكول نقل نواة الخلية الجسدية عن طريق جمع البويضات، ثم استخدم ماصة فموية لنقلها إلى قطرات من وسط K-S-O-M-A-A في طبق بتري. وفي غطاء طبق بتري.

قم بتجهيز طبق لإجراء عملية نقل نوى الخلايا الجسدية أو SCNT عن طريق وضع حوالي 10 قطرات من PVP، وحوالي 10 قطرات من HCZB يحتوي على 5 µg/mL من cyto B، وحوالي 10 قطرات من HCCB يحتوي على 2.5 µg/mL من cyto B. سيُشار إلى هذا الطبق باسم طبق S-C-N-T-A. ضع طبق S-C-N-T-A على منصة مجهر مركب مقلوب.

ضع بعد ذلك إبرة استئصال بنطاق 7 µm في المجهر الموجه (micro manipulator) واغسلها عن طريق السحب في محلول PVP للتخلص منه من 5 إلى 10 مرات. ثم انقل من 10 إلى 30 بويضة متوقفة في الطور الاستقلابي الثاني من طبق بتري إلى إحدى قطرات HCCB التي تحتوي على 5 µg/mL من Cyto B على لوحة S-C-N-T-A، وحضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وقم بمحاذاة البويضات أفقياً أثناء فترة التحضين.

بعد مرور خمس دقائق، استخدم إبرة الاستخراج لوضع البويضة أمام إبرة التثبيت. وباستخدام حاقن دقيق، قم بتطبيق تفريغ هوائي لتثبيت البويضة في الماصة الدقيقة لإبرة التثبيت.

بعد ذلك، وباستخدام إبرة استئصال النواة، قم بتدوير البويضة حتى يصبح معقد المغزل الكروموسومي، الذي يظهر أكثر شفافية مقارنة بسيتوبلازم البويضة، في وضع الساعة الثالثة، ثم ابدأ نبضة البيزو عن طريق الضغط على الدواسة لاختراق المنطقة الشفافة. نبضة البيزو هي نبضة ميكانيكية تنتقل طوليًا وتؤدي إلى اهتزاز طرف إبرة استئصال النواة. تساعد هذه الاهتزازات الطرفية في الثقب عبر المنطقة الشفافة.

بمجرد اختراق المنطقة الشفافة (zona pellucida)، ضع فتحة إبرة التنوي adjacent إلى مغزل الطور الاستوائي الثاني وقم بتطبيق تفريغ الهواء. سينتقل معقد المغزل الكروموسومي ببطء إلى داخل الإبرة. وبمجرد إزالة الإبرة، يجب أن ينغلق الغشاء من تلقاء نفسه.

أخيرًا، وباستخدام ماصة فموية، انقل الخلايا منزوعة النواة مرة أخرى إلى قطرات K-S-O-M-A-A. بعد ذلك، وباستخدام الماصة نفسها، اغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى أخرى من KSOM AA. ولإجراء عملية نقل النواة، استبدل إبرة نزع النواة ذات السبعة ميكرومتر الموجودة على المجهر المتلاعب (micro manipulator) بإبرة نقل نواة تتراوح سعتها بين أربعة إلى خمسة ميكرومتر. اغسل الإبرة باستخدام PVP كما سبق.

ضع خلايا T الموجبة لـ CD eight التي تم عزلها مسبقاً في قطرة من PVP على لوحة S-C-N-D-A. اخلط جيداً واتركها للحضانة لمدة 10 minutes على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل من 10 إلى 30 خلية منزوعة النواة (ENUCLEATED cytes) إلى قطرة من HCZB بتركيز 2.5 micrograms per milliliter.

وضع Cyto B على طبق S ct. A وتحضينه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وخلال فترة التحضين، تُستخدم إبرة النقل النووي لصف الخلايا أفقياً باستخدام إبرة الحقن.

التقط خلية مانحة موجبة لـ CD8 من وسط PVP وقم بسحبها وإخراجها عدة مرات حتى يتحلل الغشاء الخارجي. إذا لزم الأمر، قم بتطبيق نبضة بيزو؛ حيث يجب أن تكون شظايا الغشاء والسيتوسول مرئية. اسحب النواة إلى داخل الإبرة.

بعد ذلك، استمر في التقاط النوى حتى يتوفر لديك من 10 إلى 30 نواة. تالياً، انتقل إلى القطرة التي تحتوي على الخلايا المفرغة من النواة والمصطفة. قم بتطبيق vacuum لتثبيت بويضة واحدة على إبرة التثبيت.

ثم ضع إبرة نقل النوى NU بمحاذاة zop lucita مع توجيه النوى بعيداً عن الفتحة. قم بتطبيق نبضة pizo حتى تخترق الإبرة zop lucita. حرك الميكرو-مانيبولاتور (micro manipulator) بعناية لنقل نواة واحدة إلى طرف الإبرة.

ادفع الإبرة داخل البويضة حتى يصل طرف الإبرة إلى ثلثي المسافة بالداخل. قم بتطبيق ضغط سلبي بسيط بحيث يتم سحب جزء صغير من غشاء البويضة داخل الإبرة. الخطوة التالية حرجة للغاية.

بما أن هذه هي المرة الوحيدة التي تكون فيها البويضة مفتوحة بالفعل، قم بتطبيق نبضة ZO واحدة، ثم طبق ضغطاً موجباً لدفع النواة خارج الإبرة.

اسحب الإبرة بعناية للخلف بحيث يكون طرفها في حوالي ثلث المسافة داخل البويضة، ثم قم بتطبيق ضغط سلبي مع الاستمرار في سحب الإبرة للخلف لإغلاق البويضة. كرر هذه الخطوة مع كل بويضة.

بعد أن تتلقى جميع البويضات نواة، انقلها إلى طبق بتري واغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى أخرى من وسط KS OM AA المحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد التحضين، انقل أجنة SCN T إلى قطرات من وسط التنشيط الخالي من الكالسيوم الذي يحتوي على كلوريد السترونتيوم. يعمل كلوريد السترونتيوم على تنشيط البويضة عن طريق تحفيز تذبذبات الكالسيوم التي تحدث بشكل مماثل أثناء عملية الإخصاب.

يُحضن لمدة ست ساعات. وإذا رُغب في ذلك، يتم إضافة TSA، وهو مثبط غير متخصص لإنزيم histone deacetylase، إلى وسط التنشيط. ومن أجل تحسين الكفاءة بعد التنشيط، تُفحص الأجنة تحت المجهر المقلوب لتحديد كمية النويات الكاذبة أو أجنة SCNT الإيجابية لـ PPN. ويمكن تحديد PPN بناءً على مظهرها.

تبدو هذه كالبويضات. يتم غسلها وزراعتها في وضعية "Sunny side up". تُوضع الأجنة في قطرات من K-S-O-M-A-A لمدة ثلاثة أيام ونصف عند 37 degrees Celsius حتى تصل إلى مرحلة البلاستوسيت.

في البداية، يجب التركيز على تنفيذ الإجراءات التي عرضناها للتو بشكل صحيح فيما يتعلق بالتنوّي والنقل النووي NU. وبمجرد إتقان هذه التقنيات، ستصبح الإجراءات التالية أسهل في التنفيذ. أما الخلايا الجذعية الجنينية أو خلايا ES المستخدمة هنا، فقد تم اشتقاقها باستخدام تقنيات قياسية.

يجب تحضير هذه المواد في يوم الحقن بمساعدة الانفجار، أي بعد ثلاثة أيام ونصف من الجماع. يتم تحضير غطاء طبق بكتيري معقم عن طريق وضع قطرات تحتوي على PVP و HCZP. بعد ذلك، يتم تحضير إبرة حقن بحجم 15 ميكرومتر لنبضة pico كما تم سابقاً.

بعد ذلك، ضع إبرة الحقن في المجهر الدقيق (micro manipulator) واغسلها باستخدام PVP transfer. قم بإجراء من 10 إلى 30 دفعة مساعدة (blast assists) في قطرة من HCZB. ثم ضع من 5 إلى 50 µL من معلق ESL في قطرة أخرى من HCZB.

يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من خلايا ES بحيث يمكن التقاطها بسهولة، ولكن دون أن تكون متكدسة. بعد ذلك، يتم التقاط من 30 إلى 100 من خلايا ES باستخدام إبرة الحقن، ثم الانتقال إلى القطرة التي تحتوي على المساعدة في انفجار الغشاء (blast assist).

قم بمحاذاة أداة المساعدة في التفجير (blast assist) أفقيًا وثبّتها باستخدام إبرة التثبيت عن طريق تطبيق الفراغ. استخدم إبرة الحقن لتدوير أداة المساعدة في التفجير حتى تصبح الكتلة الخلوية الداخلية عند موضع الساعة التاسعة. ضع إبرة الحقن عند موضع الساعة الثالثة.

تأكد من عدم وجود خلايا ES عند طرف الإبرة، وقم بتطبيق نبضة piso حتى تخترق إبرة الحقن من خلال zop lucita وtrifecta وصولاً إلى blastic seal. قم بتحرير من 5 إلى 15 خلية ES بحيث تلتصق بالكتلة الخلوية الداخلية. استمر في ذلك حتى يتم حقن جميع blast assist، وبعد الانتهاء من عمليات الحقن.

تُغسل مرتين في K-S-O-M-A-A ثم يتم الانتقال إلى نقل الأجنة جراحياً إلى إناث حاملات كاذبة؛ حيث يتم وضع الفأرة المستقبلة الحاملة كاذبة والمخدرة في منطقة الجراحة. وباستخدام ماكينة حلاقة كهربائية، يُزال الشعر من الربع السفلي الأيمن. يتم تعقيم المنطقة باستخدام محلول يعتمد على اليود و70% ethanol تحت مجهر تشريحي.

استخدم المقص لفتح الجلد، ثم ضع المقص وهو مغلق بين الجلد والبريتون وافتحه لفصل البريتون عن الجلد. حدد موقع المبيض عبر البريتون، والذي يجب أن يظهر كنقطة حمراء. بعد ذلك، استخدم المقص لفتح البريتون في تلك المنطقة.

استخدم الملقط للإمساك بعناية بـ UCT أو الدهون المحيطة بها واسحب الرحم باستخدام أنبوب شعري متصل بمصّة فموية. اجمع مجموعة مكونة من حوالي 10 blast assists مع تثبيت قناة فالوب والرحم باستخدام الملقط. استخدم إبرة لعمل ثقب صغير في الرحم.

ثم أدخل الشعيرية المزودة بمساعد التفجير في تجويف الرحم وقم بتحريرهم. ادفع الرحم مرة أخرى إلى التجويف البطني. حدد حواف البريتون وأغلقها ببضع غرز.

أغلق جلد الفأر باستخدام عدد قليل من الدبابيس الجراحية. ثم قم بإعطاء مسكن للألم عن طريق الحقن تحت الجلد. بعد ذلك، انقل الفأر مرة أخرى إلى قفصه تحت مصباح تدفئة.

راقب تنفس الفأر حتى يستيقظ. وبعد عملية استئصال النواة ونقل نواة خلية جسدية، كانت حوالي 70% من الأجنّة إيجابية للنوى الكاذبة.

كما هو موضح في هذا الشكل. لم يكن للمعالجة بـ TSA لمدة ست أو 10 ساعات أي تأثير. وبعد ثلاثة أيام ونصف من الزرع، تطور ما بين 5 إلى 10% من الأجنة إلى بلاستوسيت (blastocysts).

ومرة أخرى، لم يكن لإضافة TSA أي تأثير على معدل تطور البلاستوسيت. تم بعد ذلك استخدام البلاستوسيت الناتجة عن SCNT لاشتقاق خلايا جذعية جنينية. وقد أدت TSA إلى تحسين المعدل الذي اشتُقت به ESL من البلاستوسيت بشكل ملحوظ.

تُستخدم خلايا S-C-N-T-E-S لتوليد فئران خيمرية. يتم سحب الدم من هذه الفئران وتحليله للكشف عن وجود خلايا T محددة باستخدام تحليل الحقائق كما هو موضح هنا. وعندما يتم صبغ الدم باستخدام جسم مضاد لـ CDA وتيتramer محدد، يمكن تحديد مجتمع موجب مزدوج.

مما يشير إلى أن الخلية المانحة المستخدمة في عملية SCNT كانت ذات خصوصية صحيحة. لقد أوضحتُ لكم للتو كيفية إجراء نقل LU للخلايا الجسدية، وحقن المساعدة في المرحلة البلاستية، ونقل الأجنة. إن أهم نقطة يجب مراعاتها هي نقاء الخلايا التائية (T-cell) أو الخلايا البائية (B cells).

بمجرد تعلم كيفية إجراء النقل الجسدي ووصول أجنّتك إلى مرحلة البلاستولة، يمكنك الاختيار بين نقلها مباشرةً إلى إناث حاملات كاذبات أو استخدامها لاشتقاق خلايا جذعية جنينية وتوليد فئران خيمرية.