Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

الفئران المعدلة وراثيا لمستقبلات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد لا غنى عنها في دراسة تطور الخلايا التائية ووظيفتها لتوليد نماذج فئران بخصائص مستقبلات الخلايا التائية المحددة مسبقا باستخدام النقل النووي للخلية الجسدية أو SCNT. يصاب الفأر بممرض ذي أهمية. يتم عزل الخلايا التائية من الفأر ثم تنقيها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت.

ثم يتم استخدام الخلية التائية المنقاة لنقل نواة الخلية الجسدية. بعد وصول الأجنة إلى مرحلة الانفجارات ، يتم عزل الخلايا الجذعية الجنينية. ثم يتم حقن هذه الخلايا في مساعدة الانفجار ، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى الفئران الحوامل الزائفة.

تعبر الجراء الناتجة عن زيادة واضحة في عدد الخلايا التائية ذات الأهمية ، والتي يمكن التحقق من صحتها عن طريق تحليل PAX. مرحبا ، اسمي Okta AK وأنا موظف هنا في المعهد الأبيض للأبحاث الطبية الحيوية. سأوضح لك اليوم كيفية إجراء حقن مساعدة انفجار نقل CLE الجسدي بالإضافة إلى نقل الجنين.

الميزة الرئيسية للنقل الجسدي هي أنه يمكن إنشاء نماذج الفئران ، والتي تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية من الموضع الداخلي ، وبالتالي تحت سيطرة المحفز الداخلي ويمكن إنشاء نماذج الماوس بسرعة كبيرة. يمكن استخدام نقل سائل الإرسال الجسدي كأداة لإنشاء نماذج ماوس بخصائص مستقبلات الخلايا التائية المحددة مسبقا أو مستقبلات الخلايا البائية. هذا له أهمية خاصة للأشخاص الذين يعملون في هذا المجال مثل المناعة الذاتية والأمراض المعدية والسرطان.

لعزل الخلايا التائية الخاصة بممرض مثل التوكسوبلازما غاندي ، البخيل المصاب بالحقن داخل الصفاق في ذروة الاستجابة المناعية ، يتم عزل الطحال من الفأر القتل الرحيم ثم يتم عزل الخلايا المانحة المتجانسة واحتضانها بأجسام مضادة مصنفة بالفلورسنت ورباعي المناسب. أخيرا ، يتم إجراء فرز الحقائق للحصول على الخلايا التائية الخاصة بممرض الأمراض. في المساء السابق لإجراء استئصال البويضات.

قم بإعداد أربع إبر وخمسة وسبعة ميكرومتر من حقن البيزو باستخدام حقنة لتحميلها بالزئبق إلى الوراء. في اليوم التالي ، ابدأ بروتوكول النقل النووي للخلايا الجسدية عن طريق جمع البويضات ، ثم باستخدام ماصة الفم ، ونقلها إلى قطرات من وسط K-S-O-M-A-A في طبق بتري. في غطاء طبق بتري.

جهز aate لإجراء النقل النووي للخلايا الجسدية أو SCNT عن طريق وضع حوالي 10 قطرات من PVP. حوالي 10 قطرات من HCZB تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من cyto B وحوالي 10 قطرات من HCCB تحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من cyto B. ضع لوحة S-C-N-T-A على مسرح المجهر المركب المقلوب.

بعد ذلك ، ضع إبرة استئصال سبعة ميكرومترات في المعالج الصغير واغسلها عن طريق الانسحاب إلى محلول PVP للتخلص من خمس إلى 10 مرات. ثم انقل 10 إلى 30 من الطور الطور اثنين من السيات المعتقلة من طبق بتري إلى إحدى قطرات HCCB بخمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. يحتضن Cyto B على لوحة S-C-N-T-A لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء الحضانة ، ويصطف البويضات أفقيا.

بعد مرور خمس دقائق. استخدم إبرة الاستئصال لوضع بويضة أمام إبرة الإمساك. باستخدام حاقن دقيق ، ضع فراغا لتثبيت البويضة على إبرة تثبيت الماصة الدقيقة.

بعد ذلك ، باستخدام إبرة الاستئصال ، أدر البويضة حتى يكون مركب مغزل الكروموسوم ، الذي يبدو شديد الشفافية مقارنة بالبلازما المرجعية في موضع الساعة الثالثة ، ابدأ نبضة بيزو بالضغط على الدواسة لاختراق zno lucita. نبضة البيزو هي نبضة ميكانيكية تنتقل طوليا وتهتز طرف إبرة التنوي. تساعد اهتزازات الطرف في الحفر من خلال zop lucita.

بمجرد المرور عبر المنطقة ، ضع فتحة إبرة التنوي المجاورة للمغزل الطور الثاني وقم بتطبيق الفراغ. سوف ينتقل مجمع مغزل الكروموسوم ببطء إلى الإبرة. بمجرد إزالة الإبرة ، يجب أن يغلق الغشاء نفسه.

أخيرا ، باستخدام ماصة الفم ، انقل الخلايا المنفصلة مرة أخرى إلى قطرات K-S-O-M-A-A. ثم باستخدام نفس الماصة ، اغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى قطرة من KSOM AA لإجراء نقل نووي ، قم بتبادل إبرة الاستئصال التي تبلغ سبعة ميكرومترات على المناور الصغير بإبرة نقل نووي من أربعة إلى خمسة ميكرومترات. اغسل الإبرة باستخدام PVP كما كان من قبل.

ضع القرص المضغوط ثماني خلايا تائية موجبة معزولة في وقت سابق في قطرة من PVP على لوحة S-C-N-D-A. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بنقل 10 إلى 30 خلية منوية النوم إلى قطرة من HCZB مع 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر.

Cyto B على S ct. يحتضن الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، استخدم إبرة النقل النووي لمحاذاة الخلايا أفقيا باستخدام إبرة الحقن.

التقط متبرعا من خلية CD ثماني موجبة من وسط PVP واستنشقها للداخل والخارج حتى يتحلل الغشاء الخارجي. إذا لزم الأمر ، قم بتطبيق نبض بيزو يجب أن تكون شظايا الغشاء والعصارة الخلوية مرئية. ارسم النواة في الإبرة.

ثم استمر في التقاط النوى حتى يكون هناك 10 إلى 30. بعد ذلك ، انتقل إلى القطرة التي تحتوي على الخلايا المحاذاة النواة. ضع المكنسة الكهربائية لتثبيت بويضة واحدة على إبرة الإمساك.

ثم ضع إبرة النقل النووي NU المجاورة ل zop lucita مع توجيه النوى بعيدا عن الفتحة. ضع نبض البيزو حتى تمر الإبرة عبر zop lucita. ادفع المعالج الدقيق لتحريك نواة واحدة بعناية إلى طرف الإبرة.

ادفع الإبرة إلى البويضة حتى يصبح طرف الإبرة ثلثي الطريق إلى الداخل. استخدم ضغطا سلبيا صغيرا بحيث يكون هناك القليل من غشاء البويضة في الإبرة. الخطوة التالية حاسمة للغاية.

لأنها المرة الوحيدة التي تكون فيها البويضة مفتوحة بالفعل. ضع نبضة ZO واحدة. ثم اضغط إيجابيا لدفع النواة خارج الإبرة.

اسحب الإبرة للخلف بحذر بحيث يكون الطرف حوالي ثلث الطريق في البويضة ، ثم اضغط سلبا واستمر في سحب الإبرة للخلف. لإغلاق البويضة. كرر هذه الخطوة مع كل بويضة.

بعد أن تتلقى جميع البويضات نواة ، انقلها إلى طبق بتري واغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى قطرة من وسائط KS OM AA التي تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة ، قم بنقل أجنة SCN T إلى قطرات من وسائط التنشيط الخالية من الكالسيوم التي تحتوي على كلوريد السترونتيوم. ينشط كلوريد السترونتيوم البويضة عن طريق إحداث تذبذبات الكالسيوم التي قد تحدث بشكل مشابه أثناء الإخصاب.

احتضن لمدة ست ساعات. إذا رغبت في ذلك ، أضف TSA ، وهو مثبط غير محدد لهيستون ثنائي أسيتيل أسيس إلى وسائط التنشيط من أجل تحسين الكفاءة بعد التنشيط ، افحص الأجنة تحت المجهر المقلوب لتحديد كمية النوى الزائفة أو أجنة نقل نواة الخلية الإيجابية PPN. يمكن التعرف على PPN بناء على مظهرها.

تبدو مثل البيض. الجانب المشمس يغسل والثقافة. تسقط الأجنة و K-S-O-M-A-A لمدة ثلاثة أيام ونصف عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة المساعدة على الانفجار.

في البداية ، يجب أن تركز على تنفيذ الإجراءات التي أظهرناها لك للتو للنوي والنقل النووي NU بشكل صحيح. بمجرد إتقان هذه التقنيات ، تكون الإجراءات التالية أسهل في إدارة الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية الجنينية المستخدمة. هنا اشتقت باستخدام التقنيات القياسية.

يجب تحضيرها في يوم الحقن بمساعدة الانفجار ، بعد ثلاثة أيام ونصف من الحقن الصوتي. تحضير غطاء طبق بكتيري معقم عن طريق قطرات الطلاء التي تحتوي على PVP و HCZP. ثم قم بإعداد إبرة حقن 15 ميكرومتر لنبض البيزو كما كان من قبل.

بعد ذلك ، ضع إبرة الحقن في المناور الصغير واغسلها بنقل PVP. 10 إلى 30 انفجار يساعد في قطرة من HCZB. ثم ضع خمسة إلى 50 ميكرولترا من تعليق ESL في قطرة أخرى من HCZB.

يجب أن يكون هناك عدد كاف من خلايا ES بحيث يمكن التقاطها بسهولة ، ولكن لا ينبغي أن تكون مزدحمة. بعد ذلك ، التقط 30 إلى 100 خلية ES بإبرة الحقن. انتقل إلى القطرة باستخدام مساعد الانفجار.

قم بمحاذاة مساعد الانفجار أفقيا وقم بتثبيت واحدة بإبرة التثبيت عن طريق تطبيق الفراغ. استخدم إبرة الحقن لتحويل مساعد الانفجار حتى تصل كتلة الخلية الداخلية إلى موضع الساعة التاسعة. ضع إبرة الحقن عند موضع الساعة الثالثة.

تأكد من عدم وجود خلايا ES عند طرف الإبرة ، وقم بتطبيق نبضة البيزو حتى تخترق إبرة الحقن zop lucita و trifecta في الختم الانفجاري. حرر من خمس إلى 15 خلية ES بحيث تلتصق بكتلة الخلية الداخلية. استمر حتى يتم حقن كل مساعد الانفجار بعد الانتهاء من الحقن.

يغسل مرتين في K-S-O-M-A-A ويتقدم إلى الجنين الجراحي نقل إلى مكان الإناث الحوامل الزائفة وتخدير الفأر المتلقي الإناث الحوامل الزائفة في منطقة الجراحة. باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، قم بإزالة الشعر من الربع الأيمن السفلي. تطهير المنطقة باستخدام محلول قائم على اليود و 70٪ إيثانول تحت مجهر تشريح.

استخدم المقص لفتح الجلد ، ثم ضع مقصا مغلقا بين الجلد والصفاق وافتحهما لفصل الصفاق عن الجلد. حدد موقع المبيض من خلال الصفاق ، والذي يجب أن يظهر كبقعة حمراء. ثم استخدم المقص لفتح الصفاق في تلك المنطقة.

استخدم الملقط للإمساك بعناية ب UCT أو الدهون المحيطة به وسحب الرحم باستخدام شعرية متصلة بماصة الفم. التقط مجموعة من حوالي 10 مساعدات انفجار تمسك قناة البيض والرحم بالملقط. استخدم إبرة لعمل ثقب صغير في الرحم.

ثم أدخل الشعيرات الدموية بمساعدة الانفجار في تجويف الرحم وحررها. ادفع الرحم مرة أخرى إلى تجويف البطن. حدد موقع حواف الصفاق وأغلقه ببضع غرز.

أغلق جلد الماوس ببعض الدبابيس. تطبيق مسكنات الألم تحت الجلد. ثم انقل الماوس مرة أخرى إلى قفصه تحت مصباح تدفئة.

راقب تنفس الفأر حتى يستيقظ. بعد الاستئصال والنقل النووي للخلايا الجسدية. حوالي 70٪ من الأجنة كانت إيجابية للنوى الزائفة.

كما هو موضح في هذا الشكل. لم يكن للعلاج ب TSA لمدة ست أو 10 ساعات أي تأثير. بعد ثلاثة أيام ونصف في المزرعة ، تطورت خمسة إلى 10٪ من الأجنة إلى مساعدة الانفجار.

مرة أخرى ، لم يكن لإضافة TSA أي تأثير على معدل تطوير المساعدة على الانفجار. ثم تم استخدام مساعدة الانفجار SCNT لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية. حسنت TSA بشكل كبير معدل اشتقاق ESL من مساعدة الانفجار.

تستخدم خلايا S-C-N-T-E-S لتوليد الفئران الخيمرية يتم سحب الدم من هذه الفئران وتحليله بحثا عن وجود خلايا تائية معينة باستخدام تحليل الحقائق كما هو موضح هنا. عندما يكون الدم ملطخا بجسم مضاد مضاد ل CDA ورباعي محدد ، يمكن تحديد مجموعة إيجابية مزدوجة.

مشيرا إلى أن الخلية المانحة المستخدمة في نقل نواة الخلية كانت ذات خصوصية صحيحة. لقد أوضحت لك للتو كيفية إجراء نقل LU للخلايا الجسدية ، وحقن مساعدة الانفجار ونقل الأجنة. أهم نقطة يجب مراعاتها هي نقاء الخلايا التائية أو الخلايا البائية.

بمجرد أن تتعلم كيفية إجراء النقل الجسدي ومرحلة الانفجار بين الأجنة ، يمكنك الاختيار بين نقلها مباشرة إلى الإناث الحوامل الزائفة أو استخدامها لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية وتوليد الفئران الوهمية.