Name: تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: تعلم بروتوكول تثبيت أجنة ذبابة الفاكهة في وضعية عمودية باستخدام مجهر ليزري مكافئ. تتيح هذه الطريقة قياسات دقيقة لحجم الأجنة وكميات البروتينات والحمض النووي الريبوزي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب مدينون بشكل خاص لهاريس وديبورا ماكاي دانيال. وقدم الدعم لهذا العمل من قبل دائرة علم الأحياء وكلية الآداب والعلوم CWRU ، وعبر منح عدد HHMI 52005866 لدعم التعليم الجامعي في مجال العلوم البيولوجية

1. التصوير المنهجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب الجليسرين هلام الاستحمام في 55 درجة مئوية الماء لمدة 20-30 دقيقة حتى يصبح سائلا متجانس. الدوامة ، ولكن لا يهز زجاجة لتجنب تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن يذوب الهلام ، وتطبيق طبقة رقيقة من الجلسرين باستخدام Kimwipe على شريحة زجاجية نظيفة (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1-1،5 مل من الجليسرين ذاب باستخدام هلام ماصة P1000 غيض قطع على سطح الشريحة لخلق طبقة رقيقة أولا. ماصة بعناية لتجنب الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ هلام لمدة 5 دقائق على سطح أفقي ، ثم ضع الشريحة في -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والشروع في محاذاة الجنين. بدلا من ذلك ، مع تغطية الشريحة التفاف ساران ووضعه في درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة قطرة صغيرة من الجلسرين الأجنة الملون في 70 ٪ / برنامج تلفزيوني أو غيره من antifade الجلسرين وسائل الاعلام المتزايدة (على سبيل المثال أو Slowfade Vectashield) على جانب من الفراش هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ قبل محاذاة الأجنة عن طريق نقل لهم بشكل فردي من الهبوط على سطح هلام. نقلها باستخدام إبرة تحت الجلد المائلة ، وذلك باستخدام الجانب مائلة كما ملعقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تقريبا على طول الأجنة 2-3 الأعمدة. إذا كان الجنين يحصل عالقا في الإبرة ، وإثارة ذلك في الانخفاض الذي يحتوي على أجنة أخرى لتحريرها. لا تضيعوا الوقت مواءمة بعناية عند هذه النقطة. ترك بعض المسافة بين الأعمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة الأجنة التي ينزلق عليها أفقيا على المدى المتوسط ​​هلام مع المعونة من الإبرة تحت الجلد. في حين ينزلق ، توجيه الرؤوس والذيول في نفس الاتجاه. جعلها موازية لبعضها البعض على طول العمود. إزالة الزائدة من الجلسرين PBS اليسار كما درب بقطعة من Kimiwipe الملتوية. ملاحظة : الجلسرين الزائد يؤدي إلى تكون الأجنة المغطى فضفاضة داخل الجل ، مما أدى إلى انفصال طبقات هلام اثنين ، مما يجعل من الصعب خفض وجبل. على العكس ، فإن إزالة الكثير من الجلسرين الجافة وتتسطح الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض قطع صفراء لانتشار طبقة رقيقة من هلام على الأجنة (50-150 ميكرولتر ، اعتمادا على كيفية العديد من الانحياز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة مكان في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة أو تخزينه في 4 درجات مئوية خلال الليل. تأكد من هلام جامدة تماما قبل عدة قطاعات. خلاف ذلك ، فإن كتلة من الأجنة يكون من الصعب جدا المكوس. ويتم الحصول على أفضل النتائج لقطع في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت نطاق تشريح ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع تماما من خلال هلام على كلا الجانبين من أجنة الانحياز. الاستمرار على شفرة حلاقة بزاوية 90 درجة لجعل التخفيضات على التوالي. وينبغي بذل تخفيضات قريبة جدا من القطبين الأمامي والخلفي من الأجنة الزائدة لتجنب هلام التي قد تعيق التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100-200 ميكرولتر من PBT الباردة (4 درجات مئوية ، في برنامج تلفزيوني +0.1 ٪ توين 20) المقبل إلى خفض وكشط بعناية قبالة هلام بين أجنة باستخدام الملعقة. ملاحظة : والمنظفات في PBT يساعد على إزالة هلام من الشريحة دون الإضرار الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة ، ونقل كتلة من الهلام مع جزءا لا يتجزأ من الأجنة إلى شريحة نظيفة لقطع أخرى. قطع كتل صغيرة مع الأجنة 5-7. استخدام PBT من التحرك بسهولة حول الكتلة الهلامية. بدلا من ذلك ، وضع كتلة على سطح الزجاج الجافة لندعه نعلق على الزجاج ، مما يخلق المزيد من الاستقرار لتقليم بدقة وهلام ، واذا لزم الامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه تستقيم الأجنة جزءا لا يتجزأ من هلام مع المعونة من شفرة الحلاقة وإبرة. لتصور تحت المجهر ، والمضي قدما مع أي واحدة من الخطوتين التاليتين ، اعتمادا على نوع المجهر الوقوف المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر مقلوب : الانتهاء من وضع الجنين في الصعود إلى كتل ساترة طويلة ، مع الأجنة في وضع مستقيم. تأكد من أن الجانب الجنين مع أقل قدر من هلام ستكون في اتصال أوثق مع الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر تستقيم : تقديم اثنين من مداخن مع coverslips # 1 four صقها مع superglue لاستخدامه ك "يدعم" ووضع الجنين في كتلة الجلسرين في بين "تؤيد". جسر الكدسات باستخدام ساترة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل مبائر ، والتحقق من مسافة عمل الأهداف التي يمكن استخدامها لمعرفة ما إذا كان يمكنك صورة كل وسيلة من خلال الجنين أو جزئيا فقط. على سبيل المثال ، D. وقد الأجنة melanogaster ~ 0.55 ملم في الطول ، ويمكن تصوير تماما باستخدام زايس 20X بخطة آبو أو 40X LD الهدف النيو فلور. الموقع التالي يحتوي على معلومات عن أهداف زايس المتاحة ويعطيك الخيار للبحث الأهداف وفقا للمسافات العمل : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. ممثل النتائج لأن ترك أجنة سليمة ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لاجراء قياسات دقيقة لحجم الجنين والمسافات بين أنماط التعبير الجيني. في الشكل 1 ، ونحن أجنة تظهر مرحلة الأريمة ملطخة دابي وصمة النووي (الأزرق) ، ومكافحة الظهرية البروتين (الحمراء) ، مرنا SOG (الصفراء) والتحالف الوطني الصومالي مرنا (الخضراء). المورفولوجية بروسسSES ، يمكن مثل انغلاف من الأديم المتوسط ​​(الشكل 2A ، B) ، والهجرة من خلايا أرومية متوسطة (الشكل 3 و 4) كما تصور أن استخدام هذا الأسلوب. ويمكن الحصول على وظائف مختلفة Z - DV على طول محور طريق تغيير الطائرة التنسيق ، كما هو مبين في الأرقام 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. شريحة تستقيم البصري للجنين في مرحلة الأريمة سليمة. تلطيخ مزدوج لمرنا والبروتين. يشار mRNAs هدفا لتحقيقات في الموقع (مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي) والبروتين التي اتسخت بسبب الأجسام المضادة الأولية (المضادة للالظهرية) في الشكل. كان يستخدم لتسمية دابي النوى. علما أن تقع على التعبير عن مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي apically في السيتوبلازم ، في حين أن التعبير عن الظهرية والنووية. ويمكن أيضا إشارات قوية من النصوص SOG الوليدة الموجودة في نوى أن ينظر في هذا التكبير. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. تحقيقات مرنا التصوير تستقيم من الجنين سليما gastrulating. المستعملة ويشار إلى الألوان كل منها في الشكل. أ) يتم التعبير عنها لاحظ أنه في هذه المرحلة ، ثلاثة جينات ملطخة ثر نفسه (SNA ، SOG والنيابة العامة ، والأخضر) ، في مجالات يفصل مكانيا. والأديم المتوسط ​​invaginating عن SNA ، وطبقة neuroblast عن دائرة الهجرة والجنسية والأديم الظاهر عن النيابة العامة ، في حين SOG التعبير لا تزال موجودة في مناطق البطني للجهاز العصبي. ب) في طائرة مبائر أعمق من الجنين نفسه ، نلاحظ قاعدة الأديم المتوسط ​​invaginating بقوة عن نظام الحسابات القومية ، ولكن منطقتها القمي عن أدنى المستويات. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. مددت رأسي من تصوير الجنين سليما مع الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). وكانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). أ) بالقرب من الطائرة البؤري رئيس الجنين. ب) طائرة أخرى للتنسيق في المنطقة جذع الجنين نفسه. علما الشامل خلايا أرومية متوسطة قبل الهجرة الجانبية (مقارنة الشكل 4) الكذب على مقربة من خط الوسط البطني على جانبي الجنين الجرثومية الفرقة الموسعة. وصفت neuroblasts Delaminating باللون الأخضر (دائرة الهجرة والجنسية وSNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. تستقيم تصوير الجنين سليما خلال تمديد الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). أ) لاحظ neuroblasts delaminating من الظهارة (السهم) ، على حد سواء الملون للصناعات والتحالف الوطني الصومالي في هذه المرحلة (الخضراء). نلاحظ أيضا التعبير مقيدة من مجموعة العمليات الخاصة في خط الوسط بطني (الصفراء). ويمكن رؤية التعبير عن النيابة العامة في هذه المرحلة في الجانبين الوحشي للجنين (النجمة). ب) القسم البصري في الجنين نفسه يظهر في قرب نهاية طول الجنين ، وهو ما يقابل منتصف الخلفي المنطقة. هي ملطخة الخلايا البطنية خط الوسط لمجموعة العمليات الخاصة.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن التقاط صور المقطع العرضي للأجنة ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون تحديا ، لأنه يتطلب إما تشريح دقيق لجهة شرائح 2 أو استخدام وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من لتجهيز مشراح ، التي عادة ما تكون مضرة لstainings الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Z - مداخن المحرز في متحد البؤر المجهر لجعل إعادة الإعمار 3D عبر قسم الصور. ومع ذلك ، فإنه يستغرق وقتا طويلا لجعل عدة شرائح رقيقة متحد البؤر لإعادة الإعمار و 3D دقيقة وphotobleaching يصبح إشكالية. مصدر آخر للقلق عند الأجنة التصوير التي تقام طوليا هو تشتت الضوء الذي يحدث عند الوصول إلى أعمق أجزاء من الجنين ، مما يعقد أيضا أخذ قياسات دقيقة للإشارات الفلورسنت لغرض تقدير مستويات بروتين تعبير أو مرنا 1. حتى مع وجود مجهر ثنائي الفوتون مبائر ، تشتت الضوء لا يزال مصدر قلق نظرا لغموض المادة صفار في منتصف الجنين ، مما يجعل اختيار وسائل الإعلام عن تزايد الشفافية المثلى من العينة أن تكون محدودة. للتحايل على هذه المشاكل ، وهي تقنية جديدة تسمى &quot;النهائي على&quot; تصوير الأجنة المواقع عموديا وضعت مؤخرا لصورة كل من يعيش وعينات ثابتة 4. في هذه الورقة ، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للأجنة عموديا الذي يسمح لإعداد تصور بسيط وثابت للأجنة أو أنسجة من أي حجم والشكل الذي هي ملطخة تحقيقات متعددة في الموضع 3. تتكون لدينا وسيلة لاستخدام وسائل الإعلام مع تصاعد الاتساق هلامي التي تستخدم لمحاذاة يغلف الاجنة في داخلها. يمكن وضع قطع من كتل هذه الوسائط التي تحتوي على أجنة متزايدة جزءا لا يتجزأ من تستقيم قبل التصوير في أي نوع من متحد البؤر المجهر. عن طريق تضمين الأجنة في هلام ووضعهم عموديا ، ونحن قادرون على اتخاذ المقاطع العرضية الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتي تعرض الخلايا على طول المحور الظهري البطني للجنين في وقت واحد. هذا هو تحسنا كبيرا منذ لأغراض القياس الكمي مشاكل تشتت الضوء وphotobleaching من الأصباغ الفلورية التي تحدث في إعادة الإعمار Z - المكدس التقليدية للأجنة التي شنت طوليا يتم القضاء الآن. وهكذا ، القياس الكمي لمستويات التعبير الجيني أو البروتين على طول المحور الظهري البطني غير دقيقة ، حيث يتم تصوير الخلايا الموجودة في مواقع الظهري البطني العكس في نفس الوقت وعلى نفس مبائر Z - الموقف. بالإضافة إلى ذلك ، وصف الأسلوب يتيح لنا الحصول على كامل 2 - D صورة عبر المحور الظهري البطني من جنين 3 - D من دون استخدام أساليب معقدة تتفتح الحسابية لتصور خلايا في مواقع مختلفة على طول المحور DV 6. بعض الخطوات الهامة تشمل إزالة الزائدة بعد الجلسرين محاذاة الأجنة ، لتجنب الانقسام بين طبقتين من جيلي. ومع ذلك ، إذا كانت العينة المجففة جدا ، فإن الصورة الناتجة تكون ممسوخ والتشكل وغير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم خفض متوسط ​​هلام حول الجنين في زاوية مستقيمة بدلا من ذلك ، قد تظهر الصورة الناتجة أقل المستديرة وأكثر في شكل البيضة ، ويرجع ذلك إلى وضع غير صحيح من الأجنة في زاوية أخرى من 90 درجة. أخيرا ، إذا لم يتم خفض هلام عن كثب بما فيه الكفاية لالجنين على نهايات الأمامي / الخلفي ، فإنه ليس من الممكن الحصول على صورة مناسبة لأن تكون المسافة الهدف يعمل تستخدم أساسا للتركيز في هلام وليس الجنين. خطوة هامة أخرى قد تكون ضرورية عند تصوير الجنين في وقت متأخر gastrulating هو فرز دقيق للمراحل ضمن نطاق الاهتمام قبل مواءمتها. عادة ، يتم وفقا لنظم الأجنة الصفات المورفولوجية التي يمكن بسهولة المعترف بها عندما تكون في وضع يمكنها الطولية. من بين التعديلات البديلة التي يمكن إجراؤها مع هذا الأسلوب هو كاشف لتشمل مكافحة تتلاشى (على سبيل المثال ف Phenylenediamine أو PPD) في الطبقة الثانية من هلام للمساعدة في حماية ضد photobleaching من الأصباغ الفلورية.

<table><tbody><tr><td>وسط تثبيت جيلاتين الجلسرين</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>يحتوي على تركيز منخفض من الفينول كمادة حافظة ويجب استخدامه داخل خزانة سحب الغازات أو في منطقة جيدة التهوية. توجد وصفة لتحضير الوسط الخاص بك في Zander, 1997.</td></tr><tr><td>مجهر Zeiss LSM 700 Confocal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>تم استخدام العدسات الشيئية التالية: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm)؛ وEC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm)؛ وLD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات مع 0.1% Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>شرائح مجهرية زجاجية</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>أغطية شرائح زجاجية</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>مقاس 1 &amp;#189; (مخصص للعدسات الشيئية المستخدمة في هذا العمل).</td></tr><tr><td>أغطية شرائح زجاجية (لصنع الدعامات)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>استخدم أربعة أغطية شرائح مثبتة بالغراء الفائق.</td></tr><tr><td>مجهر تشريح</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>شفرة حلاقة</td><td></td><td></td><td>شفرات صناعية أحادية الحافة بظهر فولاذي</td></tr><tr><td>ملعقة مختبر (Spatula)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>إبر تحت الجلد</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>عيار 26 Gauge</td></tr><tr><td>ماصات</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Upright Imaging of Drosophila Embryos

عدة معروفة تخلقية التدرجات والحركات الخلوية يحدث على طول المحور الظهري / البطنية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين. ومع ذلك ، فإن التقنيات الحالية المستخدمة لعرض مثل هذه العمليات محدودة نوعا ما. بروتوكول التالية توضح تقنية جديدة لتركيب ثابت والمسمى<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أجنة للعرض مع التصوير مبائر الاكليلية. يتكون هذا الأسلوب من تضمين الأجنة بين طبقتين من وسائل الاعلام هلام الغليسرين المتصاعدة ، وشرائط التصوير هلام المتمركزة في وضع مستقيم. الخطوة الأولى ليقحم الأجنة هو جعل الفراش رقيقة من هلام الغليسرين على شريحة. المقبل ، يتم محاذاة الأجنة بعناية على هذا السطح ، ومغطاة بطبقة ثانية من جيلي. بعد توطد الطبقة الثانية ، يتم قطع شرائح من هلام وانقلبت تستقيم للتصوير. موصوفة بدائل لتصور الأجنة تبعا لنوع من الوقوف المجهر لاستخدامه. حيث يتم تصوير كل الخلايا على طول المحور الظهري البطني داخل احد مبائر Z - الطائرة ، لدينا وسيلة تسمح للقياس والمقارنة الدقيقة للإشارات الفلورسنت دون تشتت الضوء أو photobleaching مشتركة لإعادة بناء 3D الأجنة التي شنت طوليا.

هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد الملون<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة في وضع رأسي يسمح التصوير من المقاطع العرضية باستخدام المجهر متحد البؤر.

تحدث العديد من التدرجات المورفوجينية والحركات الخلوية المعروفة على طول المحور الظهري/البطني لجنين ذبابة الفاكهة (Drosophila). ومع ذلك، فإن...

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على صور عرض إكليلية لأجنة oph سليمة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy)، والتي يمكن استخدامها لقياس حجم الجنين بدقة وتقدير مستويات تعبير البروتين وRNA. ويتحقق ذلك باستخدام وسيط تثبيت ذي قوام جيلاتيني لتغليف الأجنة بداخله وتثبيتها في وضع عمودي. كخطوة أولى.توضع الأجنة في صف واحد فوق طبقة رقيقة من هلام الجلسرين، ثم تُغطى بطبقة ثانية من هذا الوسط. بعد ذلك، يتم تقطيع وسط التثبيت الذي يحتوي على الأجنة إلى كتل، والتي يمكن قلبها رأسيًا للإمساك بها. وتؤدي وضعية الأجنة هذه عند التصوير إلى الحصول على نتائج تظهر صورًا للمقاطع العرضية التي يتم تصورها باستخدام أي نوع من المجاهر البؤرية (confocal microscope).مرحباً، اسمي ميلو. أنا طالب دراسات عليا في مختبر Meso بقسم الأحياء في جامعة Case Western Reserve. سنقوم اليوم باستعراض بروتوكول تثبيت لتصوير أجنة PHI في وضعية عرضية باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope).لقد طورنا هذه الطريقة خلال مختبر دورة علم الأحياء النمائي هنا في Case بالتعاون مع Dr. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقنية تصوير Endon التي طورها مختبر Mindin، في أنها تسمح بتحضير وتصور بسيط للأجنة أو الأنسجة المثبتة من أي حجم وشكل. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى تصور المقاطع العرضية لأجنة صغيرة جداً من أنواع gesso الأخرى، والتي سيكون من الصعب جداً تقطيعها يدوياً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على التساؤلات في مجال علم الأحياء النمائي من خلال السماح بإجراء قياسات كمية دقيقة للتعبير الجيني ومستويات البروتين على طول المحور الظهري البطني.عادةً ما يتم تثبيت الأجنة طوليًا. ورغم إمكانية الحصول على إعادة بناء لصور المقاطع العرضية باستخدام برنامج Zack، إلا أن هناك مشكلة غالبًا ما تظهر تتمثل في التبييض الضوئي للعيون الفلورية وتشتت الضوء، فضلاً عن كون هذه العملية تستغرق وقتًا طويلاً. وتعمل تقنيتنا على تقليل هذه المشكلات لأن صور المقاطع العرضية للأجنة يتم تصورها على طول نقطة بؤرية واحدة.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات عند قطع كتل الجليسرين بالقرب من طرف الأجنّة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأنها تتطلب تعاملاً دقيقاً. لدينا اليوم عرض توضيحي قدمته الطالبتان Catherine Chen و catty لتحضير أجنّة drosophila للتصوير الرأسي.أولاً، قم بإذابة هلام الجلسرين في حمام مائي عند درجة حرارة 55 degree Celsius لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة حتى يصبح سائلاً متجانساً. وتجنب رج الزجاجة لتفادي تكون الفقاعات. وباستخدام طرف ماصة P 1000 مقطوع، اسحب بحذر 1 mL من هلام الجلسرين المذاب وضعه على الشريحة.لإنشاء طبقة أولى رقيقة ومتساوية وخالية من فقاعات الهواء، اترك الهلام يتصلب لمدة خمس دقائق على سطح أفقي. ثم ضع الشريحة في مجمد بدرجة حرارة 20- درجة مئوية لمدة خمس دقائق. وبدلاً من ذلك، غطِّ الشريحة بغلاف بلاستيكي وضعها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى خمسة أيام.بمجرد تصلب الطبقة الأولى من الهلام، انقل الشريحة إلى المجهر وابدأ في عملية محاذاة الأجنة. قم بنقل كمية صغيرة من الأجنة المصبوغة ومحلول 70%PBS glycerol باستخدام الماصة إلى جانب الطبقة الأولى من الهلام. وتحت المجهر، قم بمحاذاة الأجنة جنباً إلى جنب في ثلاثة إلى أربعة أعمدة لكل شريحة.استخدم إبرة تحت الجلد لغرف الأجنة باستخدام الجانب المائل للإبرة، بحيث تعمل كملعقة. قم بتوجيه رؤوس جميع الأجنة بعناية في الاتجاه نفسه عن طريق تحريكها أفقيًا على الوسط الهلامي بمساعدة الإبرة.سيكون التكوين النهائي للأجنة المصطفة مشابهاً لذلك الموصوف في عملية حقن DNA. باستخدام قطعة ملتوية من مناديل Kim wipe، قم بإزالة فائض PBS glycerol من الأجنة. وبحذر، انقل ما بين 50 إلى 300 µL من هلام الجلسرين المذاب فوق الأجنة، اعتماداً على عدد الأجنة، لتشكيل طبقة ثانية من الهلام.أخيراً، قم بتبريد الشريحة عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، أو قم بتخزينها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ولإزالة الأجنة المغمورة في الجلسرول من الشريحة من أجل تصويرها تحت مجهر تشريحي، استخدم شفرة حلاقة لقطع الهلام بالقرب من الطرفين الأمامي والخلفي للأجنة المصطفة. أمسك شفرة الحلاقة بزاوية 90 درجة.لإجراء قطوع مستقيمة، أضف 100 إلى 200 µL من محلول PBT البارد بجانب أماكن القطع. ثم قم بكشط الهلام الموجود بجانب الأجنة بعناية. وباستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، يساعد محلول PBT في تحرير كتلة الأجنة.انقل القالب إلى شريحة مجهر جافة لإجراء المزيد من التقطيع. أولاً، قم بتقطيع قوالب أصغر تحتوي على خمس إلى سبعة أجنة بداخلها. ثانياً، قم بتشذيب الزيادة من هلام الجلسرين التي قد تعيق عملية التصوير.أخيراً، اقلب الأجنة المدمجة لتصبح في وضع عمودي بمساعدة شفرة حلاقة وإبرة. ولتصوير أجنة drosophila باستخدام مجهر كونفوكال مقلوب، ضع كتلة الجيلاتين التي تحتوي على الأجنة فوق شريحة غطاء. تأكد من أن جانب الجنين الذي يحتوي على أقل كمية من الجيلاتين هو الأكثر تماساً مع العدسة الشيئية.في حال استخدام مجهر رأسي للتصوير، يتم تحضير أربع مجموعات من غراء supra. أولاً، تُستخدم شرائح التغطية كدعامات، ويوضع قالب الأجنة في الجلسرول بين هذه الدعامات. يتم ربط المجموعات باستخدام شريحة تغطية أطول لإجراء التحليل المجهري البؤري (confocal analysis).ضع العينة على منصة المجهر. تحقق من مسافة العمل للعدسات الشيئية المراد استخدامها لمعرفة ما إذا كان بإمكانك تصوير الجنين بالكامل أم جزئياً فقط، ثم قم بإعداد تكوين المجهر البؤري (confocal) في الكمبيوتر لبدء التصوير كما هو موضح هنا. إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح، يمكن ملاحظة صور للمقاطع العرضية للأجنة ذات المورفولوجيا السليمة لأن الأجنة تظل سليمة.يمكن استخدام هذه الطريقة لأخذ قياسات دقيقة لأحجام الأجنة ومستويات التعبير الجيني عبر المحور الظهري البطني. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 30 إلى 45 دقيقة. ومن المهم إزالة الجلسرول الزائد قبل صب الطبقة الثانية من هلام الجلسرين فوق الأجنة.وإلا، فقد تنفصل الطبقتان مما يجعل خطوة القطع أكثر صعوبة. كما يجب عليك التحقق من مسافة العمل للعدسات الشيئية المستخدمة للتأكد مما إذا كان بإمكانك تصوير الجنين بالكامل أو جزء منه فقط، لأن مسافة العمل تضع قيوداً على حجم المنطقة التي يمكن تصويرها. تأكد من قطع الهلام بالقرب من جانب الجنين الذي ستضعه مواجهاً للعدسة الشيئية.وإلا، فستقوم بتصوير الهلام فقط بدلاً من الأجنة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقاط صور مقطعية لأجنة Joseph. شكراً لمشاهدتكم ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

جرحشاعثزرحشرتاد مضان التصوير المقطعي يعمل خارج حدود اختراق الأنسجة sectioning المجهري مضان. وتستند هذه التقنية على التعددية إسقاط الإضاءة والنقل وصفا الفوتون. علينا أن نظهر في الجسم الحي ، كامل الجسم التصور 3D من التشكل من GFP - معربا عن أقراص تخيلي في...

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

وتتميز التنمية في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة ، وذبابة الفاكهة السوداء البطن ، من قبل عدد من التغييرات شكل الخلية التي هي مناسبة تماما للنهج التصوير. هذه المادة سوف تصف الأدوات الأساسية والأساليب اللازمة لتصوير الأجنة الحية مبائر ذبابة الفاكهة ، وستركز على تغيير شكل خلية تسمى cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

تلوين الأجسام المضادة...

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

Immunostaining هي تقنية فعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا والبروتينات داخل الأنسجة. من خلال استخدام الصوتنة ، يخفف البروتوكول الموصوف هنا من الحاجة إلى تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة السوداء من الأجنة واليرقات في المرحلة المتأخرة قبل تلطيخ المناعة. نحن نقدم منهجية فعالة للتلوين المناعي لليرقات الكاملة المثبتة بالفورمالديهايد.

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

تسمح طريقة التصوير المستقيم الموضحة في هذا البروتوكول بالتصور التفصيلي لأقطاب ذبابة الفاكهة السوداء النامية.  يوفر هذا العرض النهائي منظورا جديدا لترتيبات وأشكال أنواع الخلايا المتعددة في الظهارة المسامية.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

نصف بروتوكولا مفصلا باستخدام الفحص المجهري الأسقفي عالي الدقة للحصول على صور ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأجنة الفئران. يستخدم هذا البروتوكول المحسن طريقة تحضير الأنسجة المعدلة لتعزيز تغلغل الصبغة الفلورية ، مما يسمح بالتحليل المورفومتري لكل من العينات الصغيرة والكبيرة الحجم.

سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.

تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

توضح هذه البروتوكولات كيفية توصيف تنظيم ووظيفة الإغلاق لوصلات القطع الصوفية المطوية في الظهارة الجنينية الضابطة والطفرة في ذبابة الفاكهة.

تجارب صبغ المناعة واختراق الصبغة لتعريف بروتينات الوصلة الحاجز ذات الطيات الأساسية في ظهارة جنين ذبابة الفاكهة

تعلم بروتوكول تثبيت أجنة ذبابة الفاكهة في وضعية عمودية باستخدام مجهر ليزري مكافئ. تتيح هذه الطريقة قياسات دقيقة لحجم الأجنة وكميات البروتينات والحمض النووي الريبوزي.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

استكشف المزيد من الفيديوهات