الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

تعد قنوات البوتاسيوم ذات التقويم الداخلي والمبوبة بالبروتين جي (grk) مهمة لتنظيم استثارة العصبونات. يمكن تنشيط قنوات Gks بواسطة كل من المستقبلات المقترنة بالبروتين جي (GPCRs)، مثل المستقبل المسكاريني M two R، وبواسطة الكحول؛ وذلك لدراسة آثار الطفرات في موقع ارتباط الكحول بـ gerk. عند تنشيطها، يتم إدخال طفرة نقطية واحدة في cDNA الخاص بـ grk عن طريق الطفرات الموجهة للموقع، ثم يتم ترنسفكشن بنى gerk المنقاة، جنباً إلى جنب مع بنى YFP، في خلايا ثديية، ويتم تقييم كفاءة الترنسفكشن عن طريق التصوير الفلوري.

يتم بعد ذلك إجراء تحليل تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (Whole cell patch clamp) لمقارنة التنشيط المعتمد على الكحول والبروتين G. سيوفر لك هذا العرض التجريبي المرئي معلومات أساسية حول كيفية دراسة وظيفة قنوات LY. سنناقش اليوم سؤالاً حول كيفية قيام الكحول بتنشيط القنوات من هذه المجموعة.

يمكن لتقنية تكوين الخلايا الموجهة بالموقع المعروضة هنا أن توفر رؤية متعمقة حول وظيفة القنوات الأيونية. كما يمكن تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى حيث يُعرف أن طفرة في جين معين تسبب مرضاً بشرياً. هذه عروض توضيحية لتقنية تثبيت الرقعة في الخلايا الساخنة، وتعد هذه التقنية بالغة الأهمية نظراً لوجود العديد من الخطوات التي تتطلب الدقة، والتعويض الإلكتروني المناسب، والممارسة لإنتاج بيانات قابلة للاستخدام.

يتم تحضير الحمض النووي DNA المستخدم في عملية عفن الخلايا (transfection) في هذا البروتوكول على النحو التالي. أولاً، يتم استنساخ وحدة GRK الفرعية، وهي DNA ناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR، مباشرة في ناقل التعبير الثديي. يتم إدخال طفرات نقطية في البلازميد PC DNA 3.1 باستخدام بادئات مصممة بشكل مناسب بالتزامن مع طقم QuickChange XL II للتطفير الموجه للموقع.

باستخدام هذا النظام، يتم إجراء تفاعل PCR حيث يتم تضاعف البلازميد بالكامل، ويتم إدخال طفرات نقطية مشفرة بواسطة البادئات. بعد تفاعل PCR، يتم هضم البلازميدات المتضاعفة باستخدام إنزيم القطع DPN one، ثم يتم تحويلها عن طريق الصدمة الحرارية إلى بكتيريا e coli من سلالة XL 10 gold ultra competent. تُزرع البكتيريا المحولة على أطباق آجار LB تحتوي على الأمبيسيلين؛ حيث تكون البكتيريا التي تحمل البلازميد مقاومة للأمبيسيلين وبالتالي ستشكل مستعمرات.

يتم التقاط المستعمرات المعزولة وتنميتها في مزارع صغيرة. ثم تُجرى عمليات استخلاص مصغرة (Mini preps) لعزل DNA البلازميد. بعد ذلك، يتم تسلسل DNA لتحديد الطفرات التي تم تحويلها بنجاح.

يتم استزراع بكتيريا E coli في دفعة أكبر وتُجرى عملية تحضير البلازميد بكميات كبيرة (maxi preps) لتجهيز كميات أكبر من DNA البلازميد، ثم يتم زرع حوالي 1×10⁵ من خلايا HEK 293T في كل بئر من بئرين في طبق يحتوي على 12 بئراً، بئر للمتحور وبئر للمجموعة الضابطة (القناة من النوع البري)، ثم تُحضن عند درجة حرارة 37 °C.

بعد مرور ثماني إلى 24 ساعة، ستلتصق الخلايا بالركيزة الخاصة بها وتصبح جاهزة لعملية التعدي (transfection). قم بإجراء التعدي للخلايا باستخدام lipo 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع إضافة 0.2 ميكروغرام من CDNA الخاص بالقناة، و 0.4 ميكروغرام من CDNA الخاص بمستقبل M two R، و 0.04 ميكروغرام من Y-F-P-C-D-N-A. ولتحديد الخلايا التي تم تعديها بنجاح، قم بحضن الخلايا لمدة 24 ساعة.

بعد مرور وقت الحضن المطلوب، ضع الخلايا على منصة مجهر فلوري مقلوب لتحديد كفاءة عفن التحول (transfection efficiency). قارن الصور الفلورية وصور تباين التداخل التفاضلي (DIC) لتحديد نسبة الخلايا التي خضعت لعفن التحول. أعِد طبق الزرع إلى الحاضنة.

قم بتنظيف شرائح التغطية الزجاجية مقاس 12 مليمتر واحفظها في الإيثانول حتى وقت الاستخدام. تخلص من بقايا الإيثانول عن طريق التعقيم باللهب داخل الكابينة المعقمة. ضع شرائح التغطية في طبق يحتوي على 24 بئراً وقم بطلائها بـ 0.2 مليجرام لكل مليليتر.

بعد 24 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection) في أطباق مطلية بالـ poly de lycine، يتم هضم الخلايا باستخدام التريبسين (trypsin) وزراعتها بكثافة 4 × 10³ خلية لكل بئر. يتم توزيع الخلايا في 4 إلى 8 آبار من طبق يحتوي على 24 بئراً، مع استخدام شرائح زجاجية غطائية مطلية بالـ poly de lycine، ثم تُحضن الخلايا لمدة إضافية تتراوح بين 24 إلى 48 ساعة قبل البدء في عملية تثبيت الرقعة للخلية بأكملها (whole-cell patch clamping). يتم تحضير أقطاب الرقعة باستخدام سحب عمودي على خطوتين وزجاج أقطاب من البوروسيليكات.

من الناحية المثالية، ستكون مقاومة القطب الكهربائي النهائي من ثلاثة إلى سبعة ميجا أوم ولن يتطلب أي معالجة إضافية مثل الصقل الحراري. بالنسبة لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamping)، ضع شريحة غطاء تحتوي على خلايا منقولة جينياً في طبق بقطر 35 مليمتر يحتوي على محلول خارجي من بوتاسيوم بتركيز 20 millimolar أو 20 K. ضع الطبق على منصة مجهر فلوريسنس مقلوب.

تستخدم إعدادات تثبيت الرقعة (patch clamping) المستخدمة هنا نظام تروية. يحتوي هذا النظام على المحاليل خارج الخلوية التي سيتم تطبيقها على الخلايا، والتي تتدفق بفعل الجاذبية عبر أنابيب متصلة بمجمع توزيع. يتم التحكم في كل محلول عن بُعد باستخدام صمام قرص مغناطيسي (solenoid pinch valve).

استخدم تباين تداخل الضوء (DIC) لضبط التركيز وتحديد موقع الخلايا. انتقل إلى مرشح YFP لتحديد الخلايا الموجبة لـ YFP. وبمجرد تحديد الخلايا الموجبة لـ YFP، ضع طرف نظام التروية، الخلية العصبية الفلورية، على مسافة تتراوح من 20 إلى 30 ميكرون أو ما يعادل طول خليتين إلى ثلاث خلايا.

املأ القطب بمحلول القطب الداخلي. وباستخدام حقنة وإبرة مرنة، انقر بلطف على القطب الممتلئ لإزالة فقاعات الهواء من الطرف. ثبّت الأقطاب في مرحلة الرأس الخاصة بمضخم AXO patch 200 B.

تحقق مرة أخرى من أن إعدادات المضخم تتوافق مع تكوين واحد. مفتاح الخلية الكاملة هو beta equals one، ومرشح التمرير المنخفض للوعاء مضبوط على 10 kilohertz. قم بتطبيق ضغط إيجابي باستخدام السرنجة والمشبك للحفاظ على نظافة طرف القطب الكهربائي.

بعد ذلك، استخدم مناولاً دقيقاً لوضع طرف القطب الكهربائي في الحمام ثم حركه ليكون فوق الخلية. قم بتحويل المضخم إلى وضع V track ومقبض المقياس إلى V track. ثم استخدم مقياس جهد إزاحة الماصة الموجود في المضخم لتصفير جهد الماصة عن طريق ضبط الجهد الظاهر على شاشة مقياس المضخم ليكون 0.00.

وبدلاً من ذلك، قم بالتحويل إلى وضع V clamp في المضخم واضغط على زر نبضة الاختبار (test pulse) لتسليم خطوة جهد اختبارية. ستظهر خطوة الجهد المستطيلة في نافذة اختبار الختم (seal test) في برنامج clamp. اضبط إزاحة الماصة (pipette offset) في المضخم لجعل التيار القاعدي صفراً nA.

سيوضح اختبار الختم مقاومة القطب الكهربائي، والتي يجب أن تتراوح بين ثلاثة إلى سبعة ميجا أوم. بعد ذلك، أغلق نافذة اختبار الختم. اختر "acquire open protocol" من القائمة المنسدلة.

بعد ذلك، اختر بروتوكول جهد محفوظ. في هذه الحالة، تم برمجة البروتوكول المختار مسبقاً لتقديم خطوة جهد واحدة تصل إلى 100- millivolts مع تدرج صعودي إلى 40+ millivolts كل ثانيتين. يتيح بروتوكول التدرج هذا مراقبة جهد الانعكاس وخاصية التقويم الداخلي لقنوات GK.

بالنسبة للقنوات الأيونية ذات البوابة الجهدية، قد يكون استخدام خطوة جهد مستطيلة أكثر ملاءمة؛ وباستخدام الضبط الدقيق للمتحكم الدقيق، اقترب من الخلية ثم حرر الضغط الموجب، وبعد ملامسة سطح الخلية، طبق ضغطاً سالباً طفيفاً. راقب الزيادة الناتجة في المقاومة في اختبار الختم. وبمجرد وصول المقاومة إلى نطاق الجيجا أوم، يكون القطب الكهربائي قد أُحكم ختمه على الغشاء.

يُشار إلى هذا باسم الختم العملاق (giga seal). باستخدام محقنة، قم بتطبيق نبضة من الضغط السلبي لكسر الغشاء والوصول إلى داخل الخلية. وبمجرد الوصول إلى تكوين الخلية الكاملة (whole cell configuration)، سيسجل اختبار الختم تيارات سعوية كبيرة تظهر على شكل طفرات أو تيارات عابرة في بداية الاختبار ونهايته.

اختبار النبض في الختم. بعد ذلك، انقر فوق زر اختبار الغشاء. في المشبك X، سجل مقاومة الوصول ومقاومة الغشاء.

سعة الغشاء في دفتر الملاحظات للتحقق من الملاءمة الأسية بالعين المجردة. تتناسب سعة الغشاء طردياً مع حجم الخلية، وتُستخدم لحساب كثافة التيار. تُستخدم مقاومة الوصول ومقاومة الغشاء لتقييم ما إذا كان التسجيل مرضياً للاستمرار.

سيكون التسجيل الجيد ذا مقاومة وصول منخفضة. الآن، أغلق نافذة اختبار الغشاء وانقر على زر اختبار الختم مجدداً؛ في نافذة اختبار الختم، اضبط V out على 40- millivolts للتعويض عن سعة الغشاء ومقاومة التوالي في المضخم، ثم قم بتفعيل خاصية whole cell cap، واضبط whole cell cap ومقاومة التوالي ذهاباً وإياباً حتى يتم تقليل الحالة العابرة (transient) ويصبح التيار خطاً مستوياً. إذا لزم الأمر، اضبط سعة الماصة باستخدام مقبض fast cap الموجود في المضخم.

سيؤدي التعويض الزائد أو الناقص إلى ترك عابر سعة متبقي. بعد ذلك، أدر مقبض تنبؤ النسبة المئوية إلى 60 إلى 80% وأعد ضبط سعة الخلية الكاملة ومقاومة السلسلة والسعة السريعة حسب الحاجة للحصول على خط مستوٍ في اختبار الختم. وأخيرًا، أدر تعويض النسبة المئوية إلى حوالي 100% دون تذبذب الخلية، مع محاولة الحفاظ على النبضة خطية قدر الإمكان من خلال إعادة ضبط مقاييس جهد سعة الخلية الكاملة ومقاومة السلسلة والسعة السريعة.

بمجرد تحقيق تعويض المقاومة والسعة، دوّن القيمة المحددة لنسبة المقاومة التسلسلية لسعة المضخم، ونسبة التعويض المتوقعة، وزمن التأخر في دفتر الملاحظات، ثم افتح صمام المحلول الخارجي لمحلول حمام 20 K للتحكم. اضبط مرشح الأوعية منخفض التمرير في المضخم على 2 kHz. بعد ذلك، ابدأ بتسجيل التيارات من خلال النقر على زر التسجيل في البرنامج.

ابحث عن خاصية التقويم الداخلي لتيار ger. تظهر هذه الخاصية على شكل تيار داخلي كبير تكون قيمته سالبة بالنسبة لجهد عكس potassium الذي يتم تحديده بواسطة معادلة nert EK، وتيار خارجي صغير تكون قيمته موجبة بالنسبة لـ ek. بعد تسجيل خط أساس مستقر، حدد التنشيط للتيارات بوساطة المستقبلات عن طريق تطبيق المحلول خارج الخلوي 20 k plus carbahol.

بمجرد ملاحظة ذروة التنشيط ووصول التيار إلى الحالة المستقرة، عُد إلى محلول حمام K وانتظر حتى يتم الوصول إلى مستوى تيار الخط القاعدي. بعد ذلك، لدراسة تنشيط الكحول لتيارات gert، انتقل إلى المحلول الخارجي المكون من 20 k زائد 100 millimolar من الإيثانول وانتظر الاستجابة القصوى.

ثم عُد إلى محلول حمام 20 K وانتظر حتى يتم الوصول إلى مستوى تيار الخط القاعدي. وأخيراً، ولتحديد تيارات gert الأساسية، انتقل إلى محلول 20 K مضافاً إليه 20 K barium وانتظر الاستجابة هنا. يجب أن يكون تثبيط تيار gerk واضحاً، بحيث يكون في أقصى درجاته عند -100 millivolts طوال الإجراء.

لاحظ رقم مسح الأثر المقابل لتطبيق المحاليل خارج الخلوية المختلفة. سيحتوي ملف clamp fit واحد على جميع المسوحات لجميع التجارب. لتحليل بيانات GK، استخدم برنامج clamp FIT 8.2.

وفقاً للإرشادات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق، تم الحصول على تسجيلين مختلفين لكامل الخلية من خلايا HEC 2 9 3 T التي تعبر إما عن قنوات GK من النوع البري أو الطافرة، وتم تحليلهما وفقاً للإرشادات الواردة في هذا الفيديو كما هو موضح هنا لـ GK النوع البري 2. تحتوي اللوحة الموجودة على اليسار على نافذة بها عدة تيارات متراكبة نتجت عن بروتوكول منحدر الجهد في وجود محاليل مختلفة. لاحظ التقويم الداخلي.

هذا هو التيار الداخلي الأكبر عند -100 millivolts في حدود 50 milliseconds على مخطط التيار. أما التيار الخارجي الصغير بين 0 و +40 millivolts في حدود 200 إلى 260 milliseconds على مخطط التيار، فهو ينشأ من قناة بوتاسيوم ذات بوابة جهد داخلية المنشأ. وهو ليس تيار Gert cursor.

يتم وضع مؤشر واحد فوق أقصى تيار داخلي، ثم تُسجل قيم المؤشر في جدول البيانات. وفي جدول البيانات، يظهر رقم التتبع والتيار عند -100 millivolts.

تتضمن البيانات التيار الأساسي، والتيارات المستحثة بواسطة الكارباكول والتيارات المثارة بالكحول، بالإضافة إلى التيار المثبط بالباريوم. وبالمثل، تظهر تيارات منحدر الجهد في وجود محاليل مختلفة. تم عرض 20 k زائد 100 millimolar من الإيثانول أو 20 k زائد خمسة millimolar من الكارباكول أو 20 k زائد الباريوم للقناة الطافرة L 2 57 w.

لاحظ أن التيارات الناتجة عن الكحول والكربوهول أصغر بشكل ملحوظ. تشير هذه النتائج إلى أن هذه الثمالة تلعب دوراً هاماً في بوابات قنوات GK بواسطة الكحول والوحدات الفرعية g beta gamma. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء طفرة في an والبدء في دراسة تأثيرها على وظيفة القناة باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية المتقدمة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذ تقنية التخليق الحيوي الموجهة لهذا الموقع في غضون يومين إلى ثلاثة أيام، مع إمكانية توسيع النطاق ليشمل خمس طفرات أو أكثر. وقد مهد تطوير هذه التقنيات الطريق لخبراء الفيزياء الحيوية للقنوات الأيونية لاستكشاف الخصائص الأساسية لوظيفة القنوات الأيونية وبواباتها. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تتيح للباحثين دراسة الأمراض البشرية التي تسببها طفرة واحدة في جين القناة الأيونية.