Name: الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: اكتشف كيفية دراسة تأثير الطفرات النقطية على وظيفة قنوات البوتاسيوم GRK باستخدام التحليل الكهربائي للخلايا الثديية. يوفر هذا البروتوكول إطاراً لفهم تنظيم القنوات الأيونية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأدلى عملنا بفضل الدعم المالي من صندوق الهبات ماكنايت علم الأعصاب (PAS) ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (R01 DA019022 ؛ PAS) ، وقبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA الدكتوراه زمالة للسلطة الفلسطينية (F31AA017042) من المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. وزودت متحولة GIRK2 - L257W الدكتور أريال Prafulla. مضان المجهر ورعايته قدمت تفضلت آلات لايكا.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

موقع الموجه الطفرات هو النهج الكلاسيكي لدراسة بنية وظيفة علاقات القنوات الأيونية. لأنه يقوم على فرضية أن طريق تغيير بقايا تنتقد القناة الايونية ينبغي للمرء أن يكون قادرا على مراقبة التغيرات وضوحا في وظيفة القناة. في المقابل ، يمكن عرض العديد من الطفرات في موقف غير الحرجة دون حدوث اضطرابات كبيرة في وظيفة القناة. عادة ، يتم تحور لأول مرة في المسألة إلى بقايا ألانين ، صغيرة غير القطبية الأحماض الأمينية ، تليها لطفرة التربتوفان ، وهو أكبر من الأحماض الأمينية 2. إذا كانت بقايا المهم وظيفة القناة ، سوف تغير كل من الطفرات نشاط القناة. إذا تحولت بقايا أقل أهمية ، وآثار الطفرة ، وبخاصة للألانين وغالبا ما تكون غير ملحوظة. الطفرات التربتوفان هي أكثر احتمالا للتسبب تغيرات بسبب العراقيل المرتبطة الفراغية حجم التربتوفان. في كثير من الأحيان ، يمكن استخدام هذه المعلومات عندما تفتقد الهيكلية ، طفرة منهجية لألانين أو التريبتوفان في غضون جزء من قناة (تسمى ألانين أو المسح التربتوفان) لتحديد موقع بقايا حرجة. ومن المهم أن نلاحظ أن الحيوانات المستنسخة يمكن إعداد متعددة مع الطفرات نقطة مختلفة في السماح موازية لاختبار مخلفات متعددة ضمن فترة زمنية قصيرة نسبيا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت هياكل الكريستال متعددة من القنوات المتاحة 3،4،5. يمكن استخدامها لاقتراح مخلفات الرئيسية المحتملة لفحصها باستخدام النهج الموصوفة في هذا البروتوكول. وينبغي على قياسات البرية من نوع القناة ترافق دائما قياس قناة متحولة لتكون بمثابة مراقبة إيجابية للتأكد من أن أجريت تجارب ترنسفكأيشن والكهربية بشكل صحيح. الطفرات قد يؤدي إلى نقطة عدم وجود الوظيفية الحالية ، وهي مشابهة للائحة الحالية من النوع البري أو تغيير نشاط القناة. قد تفتقر الحالية قابلة للقياس يكون نتيجة لسوء الاتجار لطي أو تغييرها. في مثل هذه الحالة قد يكون من المفيد معرفة ما إذا كانت القناة يتاجر بشكل صحيح على السطح باستخدام مقايسة biotinylation أو تلطيخ المناعي ضد العلامة خارج الخلية (بدون permeabilization الخلية) للتمييز بين القنوات غير وظيفية في غشاء البلازما وقنوات الاحتفاظ داخل الخلية . وأخيرا ، فإنه من المستحسن أن التحقيق ليس فقط النشاط القاعدي للقناة ولكن أيضا من عواقب الطفرات بشأن تنظيم القناة. ويمكن دراسة آليات مختلفة للتعديل وظيفة قناة تبعا للقناة أيون ذات الاهتمام بما في ذلك تنظيم مجموعة من البروتينات ، PIP2 ، الأيونات ATP التركيز ، والفسفرة (باستخدام التيروزين ، أو السيرين ثريونين الطفرة) ، أو ubiquitination sumoylation (باستخدام الطفرة يسين) وفتاحات أو حاصرات قناة مباشرة.

<table><tbody><tr><td>المواد الكيميائية</td><td>Sigma</td><td>Varies</td><td></td></tr><tr><td>طقم الاستخلاص الصغير</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>بولي-دي-لايسين هيدروبروميد</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>يمكن أيضًا استخدام بولي-إل-لايسين</td></tr><tr><td>طقم الاستخلاص الكبير</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>طقم QuickChange XL II للطفرات الموجهة لموقع معين</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>شرائح تغطية &amp;#710;&amp;#8230; 12 مم</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب زجاجي شعري من البورسيليكات – جدار قياسي</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;مجهر فلورسنت عكسي&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>الفيزيولوجيا الكهربائية</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>أي مجهر DIC عكسي&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;بخاصية الفلورة</td><td></td></tr><tr><td>مكبر الصوت</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B amplifier</td><td></td></tr><tr><td>نظام التغذية</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusion MM-6</td><td></td></tr><tr><td>المحوّل الرقمي</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 digitizer</td><td></td></tr><tr><td>الأذرع اليدوية</td><td>Sutter Instruments</td><td>ذراع يدوي: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الأقطاب</td><td>Narishige</td><td>PC10 vertical electrode puller</td><td></td></tr><tr><td>طاولة العزل</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Air table</td><td></td></tr></tbody></table>

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت heterologously في خلايا الثدييات

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

سوف نقوم شرح كيفية دراسة الآثار الفنية لإدخال طفرة نقطة في قناة أيون. ندرس بروتين G - بوابات البوتاسيوم داخليا تصحيح (المشار إليها باسم GIRK) القنوات ، والتي تعتبر هامة لتنظيم استثارة الخلايا العصبية. هناك أربعة أنواع مختلفة من الثدييات قناة GIRK مفارز (GIRK1 - GIRK4) -- ونحن نركز على GIRK2 لأنه يشكل homotetramer. التحفيز من أنواع مختلفة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، مثل مستقبلات المسكارينية (M2R) ، ويؤدي الى تفعيل قنوات GIRK. الكحول أيضا تنشيط قنوات مباشرة GIRK. وسوف نبين كيفية تحور one الأحماض الأمينية عن طريق تغيير واحد أو أكثر تحديدا النيوكليوتيدات في [كدنا] للقناة GIRK. سوف تتضخم تحور هذا التسلسل [كدنا] في البكتيريا ، وتنقيته ، وسوف يتم تأكيد وجود طفرة النقطة تسلسل الحمض النووي. وسيتم في transfected cDNAs للقنوات GIRK تحور والبرية من نوع الخلايا الجنينية البشرية في الكلى HEK293T تربيتها في المختبر. أخيرا ، سيتم استخدام خلية كاملة التصحيح ، المشبك الكهربية لدراسة التيارات العيانية البوتاسيوم من خلال القنوات وأعرب ectopically GIRK من النوع البري أو تحور. في هذه التجربة ، وسوف ندرس تأثير طفرة في L257W GIRK2 على تفعيل قنوات M2R والتي تعتمد على الكحول.

سوف نقوم شرح كيفية دراسة تأثير طفرة نقطة واحدة على وظيفة قناة أيون.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

سنقوم بتوضيح كيفية دراسة التأثيرات الوظيفية لإحداث طفرة نقطية في قناة أيونية. نقوم بدراسة القنوات المقومة داخلياً والمبوبة ببروتين G...

تعد قنوات البوتاسيوم ذات التقويم الداخلي والمبوبة بالبروتين جي (grk) مهمة لتنظيم استثارة العصبونات. يمكن تنشيط قنوات Gks بواسطة كل من المستقبلات المقترنة بالبروتين جي (GPCRs)، مثل المستقبل المسكاريني M two R، وبواسطة الكحول؛ وذلك لدراسة آثار الطفرات في موقع ارتباط الكحول بـ gerk. عند تنشيطها، يتم إدخال طفرة نقطية واحدة في cDNA الخاص بـ grk عن طريق الطفرات الموجهة للموقع، ثم يتم ترنسفكشن بنى gerk المنقاة، جنباً إلى جنب مع بنى YFP، في خلايا ثديية، ويتم تقييم كفاءة الترنسفكشن عن طريق التصوير الفلوري.يتم بعد ذلك إجراء تحليل تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (Whole cell patch clamp) لمقارنة التنشيط المعتمد على الكحول والبروتين G. سيوفر لك هذا العرض التجريبي المرئي معلومات أساسية حول كيفية دراسة وظيفة قنوات LY. سنناقش اليوم سؤالاً حول كيفية قيام الكحول بتنشيط القنوات من هذه المجموعة.يمكن لتقنية تكوين الخلايا الموجهة بالموقع المعروضة هنا أن توفر رؤية متعمقة حول وظيفة القنوات الأيونية. كما يمكن تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى حيث يُعرف أن طفرة في جين معين تسبب مرضاً بشرياً. هذه عروض توضيحية لتقنية تثبيت الرقعة في الخلايا الساخنة، وتعد هذه التقنية بالغة الأهمية نظراً لوجود العديد من الخطوات التي تتطلب الدقة، والتعويض الإلكتروني المناسب، والممارسة لإنتاج بيانات قابلة للاستخدام.يتم تحضير الحمض النووي DNA المستخدم في عملية عفن الخلايا (transfection) في هذا البروتوكول على النحو التالي. أولاً، يتم استنساخ وحدة GRK الفرعية، وهي DNA ناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR، مباشرة في ناقل التعبير الثديي. يتم إدخال طفرات نقطية في البلازميد PC DNA 3.1 باستخدام بادئات مصممة بشكل مناسب بالتزامن مع طقم QuickChange XL II للتطفير الموجه للموقع.باستخدام هذا النظام، يتم إجراء تفاعل PCR حيث يتم تضاعف البلازميد بالكامل، ويتم إدخال طفرات نقطية مشفرة بواسطة البادئات. بعد تفاعل PCR، يتم هضم البلازميدات المتضاعفة باستخدام إنزيم القطع DPN one، ثم يتم تحويلها عن طريق الصدمة الحرارية إلى بكتيريا e coli من سلالة XL 10 gold ultra competent. تُزرع البكتيريا المحولة على أطباق آجار LB تحتوي على الأمبيسيلين؛ حيث تكون البكتيريا التي تحمل البلازميد مقاومة للأمبيسيلين وبالتالي ستشكل مستعمرات.يتم التقاط المستعمرات المعزولة وتنميتها في مزارع صغيرة. ثم تُجرى عمليات استخلاص مصغرة (Mini preps) لعزل DNA البلازميد. بعد ذلك، يتم تسلسل DNA لتحديد الطفرات التي تم تحويلها بنجاح.يتم استزراع بكتيريا E coli في دفعة أكبر وتُجرى عملية تحضير البلازميد بكميات كبيرة (maxi preps) لتجهيز كميات أكبر من DNA البلازميد، ثم يتم زرع حوالي 1×10⁵ من خلايا HEK 293T في كل بئر من بئرين في طبق يحتوي على 12 بئراً، بئر للمتحور وبئر للمجموعة الضابطة (القناة من النوع البري)، ثم تُحضن عند درجة حرارة 37 °C.بعد مرور ثماني إلى 24 ساعة، ستلتصق الخلايا بالركيزة الخاصة بها وتصبح جاهزة لعملية التعدي (transfection). قم بإجراء التعدي للخلايا باستخدام lipo 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع إضافة 0.2 ميكروغرام من CDNA الخاص بالقناة، و 0.4 ميكروغرام من CDNA الخاص بمستقبل M two R، و 0.04 ميكروغرام من Y-F-P-C-D-N-A. ولتحديد الخلايا التي تم تعديها بنجاح، قم بحضن الخلايا لمدة 24 ساعة.بعد مرور وقت الحضن المطلوب، ضع الخلايا على منصة مجهر فلوري مقلوب لتحديد كفاءة عفن التحول (transfection efficiency). قارن الصور الفلورية وصور تباين التداخل التفاضلي (DIC) لتحديد نسبة الخلايا التي خضعت لعفن التحول. أعِد طبق الزرع إلى الحاضنة.قم بتنظيف شرائح التغطية الزجاجية مقاس 12 مليمتر واحفظها في الإيثانول حتى وقت الاستخدام. تخلص من بقايا الإيثانول عن طريق التعقيم باللهب داخل الكابينة المعقمة. ضع شرائح التغطية في طبق يحتوي على 24 بئراً وقم بطلائها بـ 0.2 مليجرام لكل مليليتر.بعد 24 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection) في أطباق مطلية بالـ poly de lycine، يتم هضم الخلايا باستخدام التريبسين (trypsin) وزراعتها بكثافة 4 × 10³ خلية لكل بئر. يتم توزيع الخلايا في 4 إلى 8 آبار من طبق يحتوي على 24 بئراً، مع استخدام شرائح زجاجية غطائية مطلية بالـ poly de lycine، ثم تُحضن الخلايا لمدة إضافية تتراوح بين 24 إلى 48 ساعة قبل البدء في عملية تثبيت الرقعة للخلية بأكملها (whole-cell patch clamping). يتم تحضير أقطاب الرقعة باستخدام سحب عمودي على خطوتين وزجاج أقطاب من البوروسيليكات.من الناحية المثالية، ستكون مقاومة القطب الكهربائي النهائي من ثلاثة إلى سبعة ميجا أوم ولن يتطلب أي معالجة إضافية مثل الصقل الحراري. بالنسبة لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamping)، ضع شريحة غطاء تحتوي على خلايا منقولة جينياً في طبق بقطر 35 مليمتر يحتوي على محلول خارجي من بوتاسيوم بتركيز 20 millimolar أو 20 K. ضع الطبق على منصة مجهر فلوريسنس مقلوب.تستخدم إعدادات تثبيت الرقعة (patch clamping) المستخدمة هنا نظام تروية. يحتوي هذا النظام على المحاليل خارج الخلوية التي سيتم تطبيقها على الخلايا، والتي تتدفق بفعل الجاذبية عبر أنابيب متصلة بمجمع توزيع. يتم التحكم في كل محلول عن بُعد باستخدام صمام قرص مغناطيسي (solenoid pinch valve).استخدم تباين تداخل الضوء (DIC) لضبط التركيز وتحديد موقع الخلايا. انتقل إلى مرشح YFP لتحديد الخلايا الموجبة لـ YFP. وبمجرد تحديد الخلايا الموجبة لـ YFP، ضع طرف نظام التروية، الخلية العصبية الفلورية، على مسافة تتراوح من 20 إلى 30 ميكرون أو ما يعادل طول خليتين إلى ثلاث خلايا.املأ القطب بمحلول القطب الداخلي. وباستخدام حقنة وإبرة مرنة، انقر بلطف على القطب الممتلئ لإزالة فقاعات الهواء من الطرف. ثبّت الأقطاب في مرحلة الرأس الخاصة بمضخم AXO patch 200 B.تحقق مرة أخرى من أن إعدادات المضخم تتوافق مع تكوين واحد. مفتاح الخلية الكاملة هو beta equals one، ومرشح التمرير المنخفض للوعاء مضبوط على 10 kilohertz. قم بتطبيق ضغط إيجابي باستخدام السرنجة والمشبك للحفاظ على نظافة طرف القطب الكهربائي.بعد ذلك، استخدم مناولاً دقيقاً لوضع طرف القطب الكهربائي في الحمام ثم حركه ليكون فوق الخلية. قم بتحويل المضخم إلى وضع V track ومقبض المقياس إلى V track. ثم استخدم مقياس جهد إزاحة الماصة الموجود في المضخم لتصفير جهد الماصة عن طريق ضبط الجهد الظاهر على شاشة مقياس المضخم ليكون 0.00.وبدلاً من ذلك، قم بالتحويل إلى وضع V clamp في المضخم واضغط على زر نبضة الاختبار (test pulse) لتسليم خطوة جهد اختبارية. ستظهر خطوة الجهد المستطيلة في نافذة اختبار الختم (seal test) في برنامج clamp. اضبط إزاحة الماصة (pipette offset) في المضخم لجعل التيار القاعدي صفراً nA.سيوضح اختبار الختم مقاومة القطب الكهربائي، والتي يجب أن تتراوح بين ثلاثة إلى سبعة ميجا أوم. بعد ذلك، أغلق نافذة اختبار الختم. اختر "acquire open protocol" من القائمة المنسدلة.بعد ذلك، اختر بروتوكول جهد محفوظ. في هذه الحالة، تم برمجة البروتوكول المختار مسبقاً لتقديم خطوة جهد واحدة تصل إلى 100- millivolts مع تدرج صعودي إلى 40+ millivolts كل ثانيتين. يتيح بروتوكول التدرج هذا مراقبة جهد الانعكاس وخاصية التقويم الداخلي لقنوات GK.بالنسبة للقنوات الأيونية ذات البوابة الجهدية، قد يكون استخدام خطوة جهد مستطيلة أكثر ملاءمة؛ وباستخدام الضبط الدقيق للمتحكم الدقيق، اقترب من الخلية ثم حرر الضغط الموجب، وبعد ملامسة سطح الخلية، طبق ضغطاً سالباً طفيفاً. راقب الزيادة الناتجة في المقاومة في اختبار الختم. وبمجرد وصول المقاومة إلى نطاق الجيجا أوم، يكون القطب الكهربائي قد أُحكم ختمه على الغشاء.يُشار إلى هذا باسم الختم العملاق (giga seal). باستخدام محقنة، قم بتطبيق نبضة من الضغط السلبي لكسر الغشاء والوصول إلى داخل الخلية. وبمجرد الوصول إلى تكوين الخلية الكاملة (whole cell configuration)، سيسجل اختبار الختم تيارات سعوية كبيرة تظهر على شكل طفرات أو تيارات عابرة في بداية الاختبار ونهايته.اختبار النبض في الختم. بعد ذلك، انقر فوق زر اختبار الغشاء. في المشبك X، سجل مقاومة الوصول ومقاومة الغشاء.سعة الغشاء في دفتر الملاحظات للتحقق من الملاءمة الأسية بالعين المجردة. تتناسب سعة الغشاء طردياً مع حجم الخلية، وتُستخدم لحساب كثافة التيار. تُستخدم مقاومة الوصول ومقاومة الغشاء لتقييم ما إذا كان التسجيل مرضياً للاستمرار.سيكون التسجيل الجيد ذا مقاومة وصول منخفضة. الآن، أغلق نافذة اختبار الغشاء وانقر على زر اختبار الختم مجدداً؛ في نافذة اختبار الختم، اضبط V out على 40- millivolts للتعويض عن سعة الغشاء ومقاومة التوالي في المضخم، ثم قم بتفعيل خاصية whole cell cap، واضبط whole cell cap ومقاومة التوالي ذهاباً وإياباً حتى يتم تقليل الحالة العابرة (transient) ويصبح التيار خطاً مستوياً. إذا لزم الأمر، اضبط سعة الماصة باستخدام مقبض fast cap الموجود في المضخم.سيؤدي التعويض الزائد أو الناقص إلى ترك عابر سعة متبقي. بعد ذلك، أدر مقبض تنبؤ النسبة المئوية إلى 60 إلى 80% وأعد ضبط سعة الخلية الكاملة ومقاومة السلسلة والسعة السريعة حسب الحاجة للحصول على خط مستوٍ في اختبار الختم. وأخيرًا، أدر تعويض النسبة المئوية إلى حوالي 100% دون تذبذب الخلية، مع محاولة الحفاظ على النبضة خطية قدر الإمكان من خلال إعادة ضبط مقاييس جهد سعة الخلية الكاملة ومقاومة السلسلة والسعة السريعة.بمجرد تحقيق تعويض المقاومة والسعة، دوّن القيمة المحددة لنسبة المقاومة التسلسلية لسعة المضخم، ونسبة التعويض المتوقعة، وزمن التأخر في دفتر الملاحظات، ثم افتح صمام المحلول الخارجي لمحلول حمام 20 K للتحكم. اضبط مرشح الأوعية منخفض التمرير في المضخم على 2 kHz. بعد ذلك، ابدأ بتسجيل التيارات من خلال النقر على زر التسجيل في البرنامج.ابحث عن خاصية التقويم الداخلي لتيار ger. تظهر هذه الخاصية على شكل تيار داخلي كبير تكون قيمته سالبة بالنسبة لجهد عكس potassium الذي يتم تحديده بواسطة معادلة nert EK، وتيار خارجي صغير تكون قيمته موجبة بالنسبة لـ ek. بعد تسجيل خط أساس مستقر، حدد التنشيط للتيارات بوساطة المستقبلات عن طريق تطبيق المحلول خارج الخلوي 20 k plus carbahol.بمجرد ملاحظة ذروة التنشيط ووصول التيار إلى الحالة المستقرة، عُد إلى محلول حمام K وانتظر حتى يتم الوصول إلى مستوى تيار الخط القاعدي. بعد ذلك، لدراسة تنشيط الكحول لتيارات gert، انتقل إلى المحلول الخارجي المكون من 20 k زائد 100 millimolar من الإيثانول وانتظر الاستجابة القصوى.ثم عُد إلى محلول حمام 20 K وانتظر حتى يتم الوصول إلى مستوى تيار الخط القاعدي. وأخيراً، ولتحديد تيارات gert الأساسية، انتقل إلى محلول 20 K مضافاً إليه 20 K barium وانتظر الاستجابة هنا. يجب أن يكون تثبيط تيار gerk واضحاً، بحيث يكون في أقصى درجاته عند -100 millivolts طوال الإجراء.لاحظ رقم مسح الأثر المقابل لتطبيق المحاليل خارج الخلوية المختلفة. سيحتوي ملف clamp fit واحد على جميع المسوحات لجميع التجارب. لتحليل بيانات GK، استخدم برنامج clamp FIT 8.2.وفقاً للإرشادات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق، تم الحصول على تسجيلين مختلفين لكامل الخلية من خلايا HEC 2 9 3 T التي تعبر إما عن قنوات GK من النوع البري أو الطافرة، وتم تحليلهما وفقاً للإرشادات الواردة في هذا الفيديو كما هو موضح هنا لـ GK النوع البري 2. تحتوي اللوحة الموجودة على اليسار على نافذة بها عدة تيارات متراكبة نتجت عن بروتوكول منحدر الجهد في وجود محاليل مختلفة. لاحظ التقويم الداخلي.هذا هو التيار الداخلي الأكبر عند -100 millivolts في حدود 50 milliseconds على مخطط التيار. أما التيار الخارجي الصغير بين 0 و +40 millivolts في حدود 200 إلى 260 milliseconds على مخطط التيار، فهو ينشأ من قناة بوتاسيوم ذات بوابة جهد داخلية المنشأ. وهو ليس تيار Gert cursor.يتم وضع مؤشر واحد فوق أقصى تيار داخلي، ثم تُسجل قيم المؤشر في جدول البيانات. وفي جدول البيانات، يظهر رقم التتبع والتيار عند -100 millivolts.تتضمن البيانات التيار الأساسي، والتيارات المستحثة بواسطة الكارباكول والتيارات المثارة بالكحول، بالإضافة إلى التيار المثبط بالباريوم. وبالمثل، تظهر تيارات منحدر الجهد في وجود محاليل مختلفة. تم عرض 20 k زائد 100 millimolar من الإيثانول أو 20 k زائد خمسة millimolar من الكارباكول أو 20 k زائد الباريوم للقناة الطافرة L 2 57 w.لاحظ أن التيارات الناتجة عن الكحول والكربوهول أصغر بشكل ملحوظ. تشير هذه النتائج إلى أن هذه الثمالة تلعب دوراً هاماً في بوابات قنوات GK بواسطة الكحول والوحدات الفرعية g beta gamma. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء طفرة في an والبدء في دراسة تأثيرها على وظيفة القناة باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية المتقدمة.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذ تقنية التخليق الحيوي الموجهة لهذا الموقع في غضون يومين إلى ثلاثة أيام، مع إمكانية توسيع النطاق ليشمل خمس طفرات أو أكثر. وقد مهد تطوير هذه التقنيات الطريق لخبراء الفيزياء الحيوية للقنوات الأيونية لاستكشاف الخصائص الأساسية لوظيفة القنوات الأيونية وبواباتها. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تتيح للباحثين دراسة الأمراض البشرية التي تسببها طفرة واحدة في جين القناة الأيونية.

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

طريقة موثوقة ذات كفاءة...

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

يتم وصف إجراءات إعادة كاملة من قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج في الأغشية الدهنية. القنوات المعاد هي مناسبة لفحوصات الكيمياء الحيوية، والتسجيلات الكهربائية، وفحص يجند والدراسات البلورات الإلكترون. قد يكون هذه الأساليب التطبيقات العامة للدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء الأخرى.

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

الموصوفة هنا هي إجراءات الحصول على فترات طويلة من التسجيل الحالي من قناة واحدة أيون مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة، في الوقت الحقيقي، ونمط التشكل قناة مفتوحة قريبة من التي تكمن وراء إشارة البيولوجية. هذه البيانات إعلام حول خصائص القناة في الأغشية البيولوجية دون عائق.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

الموصوفة هنا هو إجراء سريع وفعال لإعادة الوظيفية للتنقية من النوع البري والبروتين CFTR الطافرة التي تحافظ على نشاط لهذه القناة كلوريد، وهو عيب في التليف الكيسي. هروب رأس المال من يوديد proteoliposomes تشكيلها بوساطة CFTR يسمح دراسات النشاط قناة وآثار جزيئات صغيرة.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

يوضح الجزء الأول من هذه المقالة كيفية تحديد خطوط الخلايا الطافرة التي تعبر عن المبادلات الحويصلية Na + / H + في غشاء البلازما. يوفر الجزء الثاني بروتوكولات تستند إلى قياسات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا وامتصاص الأيونات السريع ، والتي تستخدم لتحديد انتقائية الأيونات والمعلمات الحركية لهذه المبادلات.

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

وغالبا ما يسبب عدم انتظام ضربات القلب ورثت من الطفرات التي تغير تسليم سطح القنوات الأيونية واحد أو أكثر. هنا، علينا أن نكيف التدفق الخلوي المقايسات لتوفير الكمي من إجمالي وسطح الخلية بروتين تعبير نسبي من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201 الخلايا.

تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

أصبح يدرس القنوات الأيونية من خلال نظام معربا عن heterologously تقنية الأساسية في البحوث الطبية الحيوية. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم وسيلة فعالة وقت لتحقيق رقابة مشددة التعبير القناة الايونية عن طريق أداء ترنسفكأيشن عابرة تحت سيطرة المروج محرض.

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

تنقية القنوات الأيونية في كثير من الأحيان تحديا، ولكن متى تحقق، فإنه من المحتمل أن يسمح التحقيقات في المختبر لوظائف وهياكل القنوات. هنا، يمكننا وصف إجراءات تدريجية للتعبير وتنقية البروتينات بيستروفين الثدييات، وعائلة من Ca2 +-تنشيط قنوات Cl– .

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

ويصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد هياكل قناة أيون بالميكروسكوب cryo-الإلكتروني، بما في ذلك نظام باكولوفيروس لكفاءة التعبير عن الجينات في خلايا الثدييات مع الحد الأدنى من الجهد وسمية واستخراج البروتين وتنقية، والتحقق من الجودة، وإعداد شبكة العينة والفحص، فضلا عن جمع البيانات وتجهيزها.

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

يصف هذا البروتوكول طريقة لدراسة بروتينات الغشاء الكهروجيني عن طريق قياس التغيرات في جهد الغشاء. يوفر هذا الفحص منصة للقراءة الوظيفية لقنوات أيونية متعددة يتم التعبير عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية.

مقايسة قائمة على التألق لإمكانات الغشاء لدراسة وظيفية عالية الإنتاجية لقناتين أيونيتين داخليتين في خطين خلويين ظهاريين

يعد الاستهداف الدوائي للقنوات الأيونية نهجا واعدا لعلاج الأورام الصلبة. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوصيف وظيفة القناة الأيونية في الخلايا السرطانية وفحص آثار معدلات القناة الأيونية على صلاحية السرطان.

فحص القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية

اكتشف كيفية دراسة تأثير الطفرات النقطية على وظيفة قنوات البوتاسيوم GRK باستخدام التحليل الكهربائي للخلايا الثديية. يوفر هذا البروتوكول إطاراً لفهم تنظيم القنوات الأيونية.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

استكشف المزيد من الفيديوهات