تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

أهلاً بكم، أنا راجا تي، باحثة دكتوراه في معهد بيكر IDI للقلب والسكري. سأصحبكم خلال الخطوات المتبعة في التوضيح ثلاثي الأبعاد للتعديلات الشرقية التي ميزت تلف DNA وتكثف الكروماتين في خلية قلبية جديدة. يلتف DNA حول مناطق نووية.

يتكون كل نيوكليوسوم من أربعة أنواع مختلفة من الهيستونات، وهي H2A و H2B و H3 و H4. ويتميز تكوين كسور DNA بفسفرة H2AX. وتحدث فسفرة H2AX هذه بشكل أساسي في الكروماتين الذي يتميز بمثيلة H3K4. سنقوم الآن باستعراض توضيح ثلاثي الأبعاد للتعديلات في الخلية المناعية المحددة بفسفرة H2AX ومثيلة H3K4.

لنبدأ العمل. نبدأ بوضع حجم محدد من معلق الخلايا في أنابيب Falcon سعة 15 مل، ثم تُغسل مرتين باستخدام محلول PBS عن طريق الطرد المركزي عند 150 G ثم إعادة التعليق.

قم بالتعليق في وسط غذائي (Media) جديد لملاحظة التأثير الفوري للإشعاع على الأحداث الخلوية. أبقِ الخلايا على العيون لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق قبل وأثناء عملية التشعيع. عرض الخلايا إما لأشعة غاما أو الأشعة السينية. بعد التشعيع، وزع 3 mL من معلق الخلايا في كل وحدة GU من أصل ست وحدات.

لوح آبار لقياس ذروة γH2AX؛ تُحضن الخلايا لمدة تتراوح بين 30 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 37 °C. نستخدم جهاز Cytospin لوضع الخلايا غير الملتصقة على شرائح زجاجية. عند تجميع مشبك Cytospin، تأكد من تطابق قرص الترشيح بالكامل مع القمع.

قم بتوزيع 50 µL من معلق الخلايا هذا على كل شريحة، ثم ضع شرائح السيتوسين في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها بسرعة 500 RPM لمدة خمس دقائق. أخرج شرائح السيتوسين وافصل الشرائح عن بطاقة الترشيح. لا تترك الخلايا تجف في الهواء لفترة طويلة لأن ذلك قد يؤثر على الخلفية في صبغ الفلوريسين.

باستخدام دبوس حجب سائل لرسم دوائر حول كل لطخة، نقوم بتثبيت الخلايا باستخدام 4%paraform head في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وبالمقارنة مع الإيثانول أو الزيت، لوحظ تثبيت أفضل باستخدام 4%paraform head. يتم غسل الشرائح بـ PPS ونفاذ الخلايا باستخدام Triton X 100 في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بالمقارنة مع twin 80، لاحظنا إشارة أفضل في الخلايا باستخدام Triton X 100. يتم مراقبة الخلايا باستخدام PP S3 ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق في كل مرة. تُحجب الخلايا باستخدام BSA بنسبة 1% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتُكرر هذه العملية ثلاث مرات عند مقارنتها بعوامل وأوقات حجب أخرى.

كان BSA الأكثر كفاءة في تقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية؛ حيث استخدمنا جسمين مضادين أوليين بتركيز تخفيف 1:500 مع 1% BSA، وبكمية تقريبية تبلغ 50 microliters من الجسم المضاد الأولي لكل شريحة. ويؤدي تحضين الجسم المضاد الأولي في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة إلى تقليل صبغ الخلفية مقارنة بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربع degrees centigrade. تُغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

تم استخدام Alexa floor 4 88 كمضاد للفأر جيد، و Alexa floor 5 46 كمضاد للأرنب. استُخدمت الأجسام المضادة الثانوية لصبغ علامات مختلفة في آن واحد. استخدم أجساماً مضادة تم إنتاجها في أنواع مختلفة من الكائنات.

أضف حوالي 50 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل شريحة. قم بحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. يُوصى بحضن الخلايا داخل غرفة رطبة لمنع جفاف الخلايا والأجسام المضادة، ثم اغسل الشرائح باستخدام PB S ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة.

أُضيف 50 µL من تخفيف بنسبة 1:500 من topo three في PBS إلى كل شريحة. تُغسل الشرائح بـ PBS ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق في كل مرة. تُزال الرطوبة الزائدة من الشرائح ثم يُضاف محلول Antifa.

يوصى بعدم تجفيف الخلايا تماماً قبل إضافة محلول Antifa. ضع غطاء الشريحة فوق الشريحة، مع الحرص على تجنب تكون أي فقاعات هوائية.

تُترك الشرائح طوال الليل في غرفة رطبة ومظلمة. تُختم الشريحة بطلاء الأظافر لمنع جفاف الخلايا. وتكشف الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر confocal عن.

تم الحصول على دقة مكانية أفضل واستُخدم ليزر الهيليوم لالتقاط الصور. وفُضِّل استخدام عدستين شيئيتين بفتحة زيت 63 مقارنة بالعدسات ذات التكبير الأعلى أو الأقل. ومن شأن عامل تكبير يتراوح بين ثلاثة أو أربعة أن ينتج صورة ذات دقة أفضل.

لإجراء حسابات FO من خلايا متعددة، يُفضل استخدام سرعة مسح تبلغ 8، وحجم صورة يبلغ 1024 في 1024 بكسل للخلايا. وعند التصوير لقنوات متعددة، يُوصى باستخدام استحواذ المسح الخطي المتسلسل مقارنة بالمسح الإطاري. ولتجنب بهتان العينة، يتم ضبط كسب الكاشف وإزاحة المضخم لتقليل الضوضاء وتشبع الإشارة.

بما أن حجم Kama HX X four قد يكون أقل من 0.5 micrometers، فمن المستحسن التقاط الصور بدقة 0.5 micrometer على الأقل. كما يتطلب الحصول على صور بحجم خطوة محدد على طول محور النفاثة استخدام نمط سلسلة النفاثات، مع تطبيق نمط "العلامة أولاً" ثم "فقدان العلامة". ولتوضيح العلاقة المكانية بين البروتينات المختلفة، يُنصح باستخدام سرعة مسح تبلغ six مع حجم صورة 2048 و 2 48 pixels باستخدام metamor first.

ثانياً، يمكن إجراء العد من الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجاهر بؤرية مختلفة. افتح علامات صور gamma hgx إما مباشرة من قائمة الملفات أو باستخدام أرقام الفواتير. العلامات. انتقل إلى قائمة المعالجة واختر Stack arithmatic.

اختر الإسقاط الأقصى (maximum projection) وحدد المستويات المراد تضمينها، ثم انقر موافق. الآن اختر top hat وحدد صورة Gamma H two X كصورة مصدر، ثم اضغط تطبيق.

سيكون مرشح القبعة العلوية (Top hat filter) والصورة الناتجة عبارة عن صورة ثنائية ذات ضجيج أقل وتباين منخفض في شدة البؤر. انتقل إلى المناطق (regions) واختر أداة رسم المناطق وارسم مناطق حول النوى. انتقل إلى قائمة المعالجة (process) واختر عتبة الصورة (threshold image).

اختر عتبة التضمين وحدد قيم العتبة الدنيا والعليا. عادةً ما تكون قيم العتبة هي التي تؤثر على الأرقام الأربعة. قيمة العتبة المثلى هي التي تقلل من تضمين الخلفية إلى أدنى حد وتزيد من تضمين الفراغ إلى أقصى حد.

يمكن تحقيق ذلك على أفضل وجه من خلال حساب عدد الجولات باستخدام قيم عتبة مختلفة. ومن ثم مقارنة عدد الجولات بالعد بالعين المجردة. اختر صورة DPI ثم انتقل إلى قائمة المناطق واختر خيار نقل المناطق.

الآن أصبح لدينا صور الفحص والأنوية المقابلة جاهزة للعد. يتم نقل معظم مناطق الأنوية إلى top hat. انتقل إلى قائمة measure واختر integrated ary analysis أو IMA، ثم حدد Measure all regions وانقر على measure للحصول على عدد FTE.

يمكن الآن تصدير أعداد FTE من كل منطقة إلى جدول بيانات باستخدام خيار Log data. افتح صور جهاز عرض jet التي تم إنشاؤها مسبقاً لكل قناة، ثم انتقل إلى display واختر color align.

حدد الصور المصدرية المقابلة لكل قناة لإنشاء صورة مدمجة لجميع القنوات الثلاث. يتم إجراء تحليل المسح الخطي لتوضيح التموضع المكاني لعلامات مختلفة داخل النواة. انتقل إلى شريط أدوات القياس واختر أمر تحليل المسح الخطي، ثم ارسم خطاً عبر الخلية.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء رسم بياني يوضح شدة الفلورة لكل قناة على طول الخط، وهو ما يمثل المسافة بين العلامات المختلفة بالنسبة لبعضها البعض. لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد من مكدس من الصور، انتقل إلى قائمة المكدس (stack menu) واختر إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D reconstruction). اختر نوع إعادة البناء ثلاثية الأبعاد "الحد الأقصى" (maximum).

اختر مخطط الدوران، وحدد مسافة معايرة النفث. عادةً ما يحدد المستخدم الإعدادات ثم ينقر موافق لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. وبهذا نكون قد انتهينا من البروتوكول الخاص بالتلوين المناعي الفلوري وتحليل الصور.

باختصار، يُعد المجهر البؤري المناعي الفلوري تقنية مزدوجة للتصوير ثلاثي الأبعاد لعلامات C المختلفة وبؤر gamma H2AX في نواة الخلية. شكراً للمشاهدة.