تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

مرحبا ، أنا رجا تي أقوم بعمل درجة الدكتوراه في معهد بيكر IDI للقلب والسكري. سآخذك من خلال الخطوات التي ينطوي عليها الرسم التوضيحي ثلاثي الأبعاد للتعديل الشرقي الذي ميز تلف الحمض النووي والتكثيف اللوني في خلية قلبية جديدة. يتم لف الحمض النووي حول المناطق النووية.

يتكون كل نيوكليوسوم من أربعة أنواع مختلفة من الهستونات ، H اثنين A و H اثنين b و H ثلاثة و H أربعة رادع. تكوين فواصل الحمض النووي ويتميز هذا ب PHO من H two X.يحدث هذا pho من H two X بشكل رئيسي في الكرياتين الذي يتميز بمثيلة H ثلاثة K أربعة. الآن سننظر في الرسم التوضيحي ثلاثي الأبعاد للتعديلات في ملصق المناعة الخلية الخاص بك مع طبقة pho H اثنين X و H Three K أربعة ميثيلي.

هيا بنا نبدأ. نبدأ بوضع المسار E لتعليق الخلية في 15 مل. يتم غسل أنابيب Falcon S مرتين برائحة PB عند 50 جم وإعادة الجسم.

تعليق في وسائط جديدة لرؤية التأثير الفوري للإشعاع على الأحداث الخلوية. احتفظ بالخلايا على العينين لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل الإشعاع وأثناءه. تعريض الخلايا إما لإشعاع جاما أو الأشعة السينية بعد الإشعاع ، قم بتوزيع ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية في كل GU من ستة.

لوحة البئر لذروة جاما H اثنان X تحتضن الخلايا بين 30 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. نستخدم مهمة السيتوزين لوضع الخلايا غير الملتصقة على شرائح زجاجية. عند تجميع مشبك السيتوزين ، تأكد من أن سلك المرشح بالكامل يتزامن مع القمع.

الاستغناء عن واحد 50 ميكرولتر ، ومسح هذا المعلق الخلوي في كل السيتوزين النهائي ، ضع مقاطع السيتوزين في مهمة السيتوزين وتدويرها 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة مقاطع السيتوزين وافصل الشرائح عن بطاقة الفلتر. لا تدع الخلايا تجف في الهواء لفترة طويلة لأنها قد تؤثر على الخلفية في تلطيخ الفلورسين.

باستخدام دبوس حجب السائل يرسم دوائر حول كل مسحة ، نقوم بإصلاح الخلايا برأس طفيلي بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بالمقارنة مع الإيثانول أو ol ، لوحظ تثبيت أفضل مع رأس باراشكلي بنسبة 4٪. منزلقات الرياح مع خلايا بيرم PPS مع Triton X 100 في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بالمقارنة مع التوأم 80 ، لاحظنا إشارة أفضل في الخلايا لكل Triton X 100. راقب الخلايا التي تحتوي على PP S3 مرات لكل منها لمدة خمس دقائق. قم بحظر الخلايا في شخص واحد BSA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وكرر ذلك ثلاث مرات عند مقارنته بعوامل الحجب الأخرى والأوقات.

كان BSA هو الأكثر كفاءة في تقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الأولية ، استخدمنا جسمين مضادين أساسيين مخففين واحد من كل 500 مع 1٪ BSA عند حوالي 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي لكل شريحة. يقلل حضانة الجسم المضاد الأولي في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة من تلطيخ الخلفية مقارنة بالحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

اليكسا الطابق 4 88 ، جيد مضاد للماوس وأليكسا الطابق 5 46 كلمة مضادة للأرانب. تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية للبقاء علامات مختلفة في وقت واحد. استخدم الأجسام المضادة التي يتم تربيتها في أنواع مختلفة.

أضف ما يقرب من 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل شريحة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. يوصى باحتضان الخلايا في غرفتك الرطبة لأنها ستمنع الخلايا والأجسام المضادة من تجفيف شرائح الغسيل باستخدام PB S3 مرات لكل منها لمدة خمس دقائق.

إضافة 50 ميكرولترا من واحد من كل 500 تخفيف من توبو ثلاثة في PBS إلى كل شريحة. اغسل الشرائح باستخدام PBS لمدة ثلاث مرات لكل منها لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الرطوبة الزائدة من الشرائح وأضف محلول أنتيفا.

يوصى بعدم تجفيف الخلايا تماما قبل إضافة محلول أنتيفا. ضع زلة غطاء على الشريحة. يجب أن تؤخذ K لتجنب تكوين أي فقاعات هواء.

اترك الشرائح طوال الليل في غرفة رطبة داكنة. أغلق الشريحة بطلاء الأظافر لمنع جفاف الخلايا. الصور المكتسبة المجهر متحد البؤر تكشف عن كشف.

اختفت الدقة المكانية الأفضل وتم استخدام ليزر الهيليوم للحصول على الصورة. يفضل الجسم 63 الذي ينبع منه الزيت عدستان على عدسات التكبير الأعلى أو الأقل. سينتج عامل التكبير / التصغير البالغ ثلاثة أو أربعة صورة بدقة أفضل.

لحساب FO من العديد من الخلايا ، يفضل استخدام سرعة مسح ضوئي تبلغ ثمانية ، بحجم صورة 1024 إلى 1024 خلية بكسل. عند التصوير لقنوات متعددة، يوصى بالحصول على مسح خطي متسلسل مقارنة بمسح الإطار. لتجنب تبييض العينة ، يتم ضبط كسب الكاشف وإزاحة مكبر الصوت لتقليل الفئران وتشبع الإشارة.

نظرا لأن حجم Kama HX X four قد يكون أقل من 0.5 ميكرومتر ، فمن المستحسن الحصول على صور لا تقل عن 0.5 ميكرومتر. حجم الخطوة على طول صور المحور النفاث مطلوب في نمط سلسلة نفاثة باستخدام العلامة أولا ووضع علامة على النمط المفقود. لتوضيح العلاقة المكانية بين البروتينات المختلفة ، والتي يوصى باستخدام سرعة مسح ستة بحجم صورة 2048 و 2 48 بكسل باستخدام metamor أولا.

ثانيا يمكن عدها من الصور التي تم الحصول عليها على مجاهر متحدة البؤر المختلفة. افتح علامات صورة جاما hgx إما مباشرة من قائمة الملفات أو باستخدام أرقام الفواتير. العلامات. انتقل إلى قائمة العملية واختر Stack arithmatic.

اختر الحد الأقصى للعرض وحدد الخطط المراد تضمينها. وانقر فوق موافق. اختر الآن القبعة العلوية وحدد صورة Gamma H two X كصورة مصدر تنطبق.

سيكون مرشح القبعة العلوية والصورة الناتجة صورة ثنائية مع ضوضاء أقل وتباين أقل في شدة البؤر. انتقل إلى المناطق وحدد أداة رسم المنطقة وارسم مناطق حول النوى. انتقل إلى عملية وقائمة وبيع صورة العتبة.

اختر حد التضمين وقم بتعيين قيم الحد الأدنى والأعلى. عادة ما تكون قيم العتبة هي التي تؤثر على الرقم الأربعة. قيمة العتبة المثلى هي تلك التي تقلل من إدراج الخلفية وتزيد من إدراج الغزوة.

يمكن تحقيق ذلك بشكل أفضل عن طريق حساب رقم غزوة باستخدام قيم عتبة مختلفة. ثم قارن رقم الغزوة مع عد العين المجردة. حدد صورة DPI وانتقل إلى قائمة المناطق وحدد خيار نقل المناطق.

الآن لدينا غزوة مقابلة وصور نووية جاهزة للعد. يتم نقل معظم المناطق النووية إلى القبعة العلوية. انتقل إلى القياس والقائمة وحدد التحليل المتكامل أو IMA ، حدد قياس جميع المناطق وانقر فوق القياس للحصول على رقم FTE.

الآن يمكن تصدير أرقام FTE من كل منطقة إلى جدول بيانات باستخدام خيار بيانات السجل. افتح صور جهاز العرض النفاث الذي تم إنشاؤه مسبقا لكل قناة. انتقل إلى العرض وحدد محاذاة الألوان.

حدد الصور المصدر المعنية لكل قناة لإنشاء صورة للقنوات الثلاث جميعها. يتم إجراء تحليل مسح الخط لتوضيح الوضع المكاني لعلامات مختلفة في النواة. انتقل إلى أمر قياس أشرطة الأدوات وحدد الخط الجاف لتحليل مسح الخط عبر الخلية.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء رسم بياني يوضح شدة الفلورسنت لكل قناة على طول الخط ويمثل مسافة العلامات المختلفة فيما يتعلق ببعضها البعض. لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد من مكدس، انتقل إلى قائمة مكدس واختر إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. حدد نوع إعادة بناء 3D كحد أقصى.

اختر خطة الدوران ، واختر مسافة معايرة الطائرة. عادة ما يحدد المستخدم النقر فوق موافق لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. وبهذا يختتم بروتوكولنا للفلور المناعي والتلوين وتحليل الصور.

باختصار ، المجهر متحد البؤر المناعي هو تقنيتان للمرئيات ثلاثية الأبعاد لعلامات C المختلفة و gamma H two X foy في نواة الخلية. شكرا للمشاهدة.