من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالإعداد الآلي السريع والموثوق للمصفوفات المستندة إلى QPCR. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مجموعات التمهيدي أولا للمصفوفة وإعداد عينات الخلطات الرئيسية ليتم فحصها. بعد ذلك ، يتم استخدام إعداد PCR الآلي الآلي أو نظام الماصة الإلكترونية المصفوفة لمجموعات مزيج العينات الرئيسية والبرايمر بدقة في كل بئر من لوحة 384 بئر.

بمجرد التحضير ، يتم تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل 384 جيدا باستخدام برنامج PCR القائم على الإنترنت الكهربائي الخفيف 4 80. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تحليل بيانات QPCR وتحديد مستويات التعبير النسبية لكل زوج تمهيدي تم اختباره ، ويستهدف كل منها mRNA معينا. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات في التعبير عن مجموعات كبيرة من الحمض النووي الريبي المرسال.

لذلك يمكن للمصفوفات المطورة خصيصا استهداف ملفات تعريف الحمض النووي الريبي الجزئي الكاملة أو مسارات أو جزيئات محددة مفتاح العدوى الفيروسية من خلال التنميط القائم على QPCR. مرحبا ، أنا ديرك DMA من قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. سنوضح لك اليوم كيفية إعداد QQPC rra في الوقت الفعلي وسنعرض لك طريقتين.

أحدهما باستخدام ماصة غير منتظمة والآخر باستخدام روبوت. نستخدم هذه التقنية لقياس ما قبل الحمض النووي الريبي الميكروي والحمض النووي الريبي الميكروي الناضج في الأورام البشرية. سيتم تنفيذ المظاهرة اليوم من قبل بولين تشو وكريستين بو.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، استرجع الألواح التمهيدية التي تحتوي على 186 زوجا أوليا في 96. تنسيق جيد عند 0.5 picaMoles مخزنة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد إذابة الألواح في درجة حرارة الغرفة ، قم بدوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة. أيضا ، قم بإذابة الثلج الأخضر السيبراني مرتين من مزيج PCR في درجة حرارة الغرفة لإعداد كل 96 لوحة أولية بئر ، وستكون هناك حاجة إلى أربعة أنابيب خلط رئيسية. قم بإعداد المزيج الرئيسي عن طريق الجمع بين أربعة ميكرولترات من مزيج الإنترنت الأخضر ، وثلاثة ميكرولتر من الماء من فئة PCR و 10 إلى 20 نانوغراما من عينة الحمض النووي أو CDNA لكل تفاعل في كل من أربعة أنابيب من أنابيب einor سعة ملليلتر.

يجب أن يحتوي كل أنبوب على مزيج رئيسي كاف لما يقرب من 100 تفاعل، مما يسمح بفائض نفايات سحب العينات. دوامة أنابيب einor لخلط. ابدأ في إعداد مقايسة الحمض النووي الريبي الصغير السلائف باستخدام روبوت Tecan EVO مع تهيئة الروبوت وتحميل برنامج تآكل EVO.

ثم اغسل الروبوت ثلاث مرات ب 30 مل من سائل النظام لتنظيف النظام من فقاعات الهواء التي تتداخل مع دقة سحب العينات. بعد ذلك ، قم بإعداد منصة الروبوت لتشمل لوحة 384 بئر و 96 لوحة تمهيدية بئر. يمزج السيد حضانا يحتوي على 2٪ مبيض ، ونظام مملوء ، وحاوية سوائل ، وحاوية نفايات فارغة.

ابدأ تشغيل الروبوت الآلي عن طريق تحديد تشغيل مرتين في نهاية البرنامج. قم بإزالة لوحة البئر 384 وأغلقها بورق التدوير الخفيف أربعة 80 رقائق سقف. ثم الطرد المركزي اللوحة.

ضع لفترة وجيزة لوحة البئر 384 المختومة في الموضع الأول من الفندق. ثم كرر هذه العملية للوحة التمهيدي الثانية مع خلطات رئيسية جديدة ولوحة بئر 384 جديدة. ضع لوحة العالم 384 المختومة الناتجة في الموضع الثاني من الفندق.

افتح برنامج تآكل EVO جديدا لتحميل الدراجة الخفيفة من الفندق وقم بتعيين معلمات ركوب الدراجات. ثم حدد تشغيل مرتين. ستقوم Freedom Evo تلقائيا بتحميل كل لوحة في الدراجة الخفيفة وتشغيل برنامج ركوب الدراجات عبر الإنترنت الأخضر وإدارة الموارد.

بمجرد الانتهاء. مراجعة وتحليل النتائج كما هو موضح في البروتوكول المكتوب كبديل لاستخدام الروبوت. يمكن استخدام ماصة إلكترونية مصفوفة متعددة القنوات للبدء في وضع محتويات أنبوب المزيج الرئيسي في خزان.

اضبط الماصة الإلكترونية على شفط 16 ميكرولترا من المزيج الرئيسي مع خطوتين لتوزيع ثماني ميكرولتر متبوعة بخطوة تطهير. بعد ضبط الماصة، استنشق 16 ميكرولترا من المزيج الرئيسي وابدأ في الاستغناء عنها في لوحة عجلات 384. قم بتوزيع أول ثمانية ميكرولترات في كل صف آخر في العمود الأول باستخدام الصفوف من A إلى O ، مع ترك العمود التالي فارغا.

قم بتوزيع الثمانية ميكرولترات الثانية في نفس صفوف العمود الثالث. ثم قم بتطهير حاوية النفايات وتخلص من النصائح باتباع هذا النمط من ترك صفوف بديلة وأعمدة بديلة. قم بالتوزيع عبر اللوحة لمدة خمس دورات أخرى لخلط الماصة الرئيسي اثنين.

استخدم نفس الصفوف مثل المزيج الرئيسي الأول، ولكن ابدأ بالعمود الثاني. كرر هذا الإجراء للخلطات الرئيسية ثلاثة وأربعة ، بدءا من العمودين الأول والثاني على التوالي ، ولكن هذه المرة باستخدام الوردة B إلى P.Her اقتباس من اللوحة التمهيدية. اضبط ماصة إلكترونية لشفط ميكرولترين وقم بتوزيع ميكرولترين مع خطوة تطهير يجب اتباعها.

انقل ميكرولترين من الاشعال من العمود الصف الأول A إلى H من لوحة تمهيدية 96 جيدا إلى كل عمود تجديف آخر واحد من 384 لوحة التطهير فوق حاوية النفايات وتخلص من الأطراف. كرر هذا النمط للتمهيدي quatt للمزيج الرئيسي الثلاثة المتبقي من العمودين الأول والثاني. ثم استمر في هذه العملية للأعمدة من اثنين إلى 12 من لوحة التمهيدي 96 جيدا التي تتحرك فوق كل عمودين في لوحة البئر 384 لكل عمود أولي.

بعد ذلك ، قم بإغلاق الألواح بسقف دراجة خفيف ورقائق معدنية وأجهزة طرد مركزي. بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة. ضع اللوحات في دورة خفيفة أربعة 80 وقم بتدوير الألواح باستخدام تنسيق الكشف عن إدارة الموارد البشرية باللون الأخضر الإلكتروني.

باستخدام نفس ظروف ركوب الدراجات كما كان من قبل ، كرر هذا الإجراء باستخدام اللوحة التمهيدية الثانية Eloqua في صفيحة 384 بئر جديدة باستخدام الخلطات الرئيسية المعدة حديثا. تظهر توقيعات الحمض النووي الريبي الجزئي السلائف من خلال التنميط باستخدام مصفوفة جديدة قائمة على QPCR. تم حساب متوسط التصوير المقطعي المحوسب دلتا كما تم تطويعه إلى U ستة وتم تحميل القيم الموحدة في المصفوفة.

برنامج ثانوي ينتج عنه ثلاث مجموعات متميزة معروضة كخرائط حرارية. يظهر التعبير النسبي لكل سلائف من الحمض النووي الريبي الجزئي باللونين الأحمر والأزرق يمثل زيادة وانخفاضا في التعبير النسبي على التوالي. تشير شدة اللون إلى درجة تغير التعبير.

خضعت غالبية السلائف microRNAs لتغييرات صغيرة ضئيلة كما هو متوقع. ومع ذلك ، زاد جزء صغير من الحمض النووي الريبي الصغير السلائف بشكل كبير طوال تجربة الدورة الزمنية. بالإضافة إلى ذلك ، انخفض المستوى النسبي لبعض السلائف microRNAs بشكل كبير.

في بعض الحالات. كما أنها تتجمع معا في تحليل الخريطة الحرارية. اعتمادا على التجربة ، قد تظهر مجموعات تعتمد على العدوى الفيروسية ، أو التعبير الخاص بنوع الخلية عن microRNAs السليفة أو السلائف microRNAs التي يتم تنظيمها بواسطة جزيء مشترك أو مسار إشارات.

يتم عرض متوسط عتبات الدورة أو CTS من عينة سلبية مرتبطة بفيروس الهربس المرتبطة بساركوما بوسي تعمل بأربع مكررات. الأهم من ذلك ، لم يتم اكتشاف المستضد النووي المرتبط بزمن انتقال فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي أو KSHV Lana في هذه العينة بواسطة مجموعة QPCR عالية الحساسية. ومع ذلك ، تم التعبير عن كل من التحكم الداخلي U six و let seven a a procior البشري micro RNA المعبر عنه بمستويات يمكن اكتشافها.

أخيرا ، كما هو متوقع ، لم ينتج عن التحكم السلبي في المياه من الدرجة PCR منتج A-Q-P-C-R. تحليل منحنى الانصهار لاثنين من البادئات المختلفة. يتم عرض استخدام نفس نسخة العينات المكررة.

من الواضح أن درجة حرارة الانصهار تختلف بالنسبة لزوجين أوليين ، لكن العينة تذوب عند نفس درجة الحرارة بالضبط لكل تكرار. قد تتضمن علامات العينة السيئة أو التي يحتمل أن تكون ملوثة عدة قمم ذوبان تشير إلى وجود مصدرين مختلفين للمدخلات. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إعداد تجارب QPCR في الوقت الفعلي باستخدام الروبوت.

من المهم أن تقوم بتضمين جميع عناصر التحكم وأكبر عدد ممكن من جينات التدبير المنزلي. لذا شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.