أساليب التلاعب التجريبية بعد Transection العصب البصري الثدييات في الجهاز العصبي المركزي

الخلايا العقدية الشبكية أو RG cs هي خلايا عصبية في الجهاز العصبي المركزي تنقل المعلومات المرئية من شبكية العين إلى الدماغ عبر العصب البصري. في الفيديو المصاحب ، تم عرض طريقة لللواط أو قطع المحاور الخاصة بجميع سكان RGC كنموذج لموت الخلايا العصبية موت الخلايا المبرمج في الجهاز العصبي المركزي للبالغين. هنا تقترن هذه الطريقة بإجراءات تستهدف بشكل مباشر العوامل العصبية ، أو الحمض النووي الريبي القصير المتداخل ، أو البلازميدات ، أو النواقل الفيروسية التي تشفر البروتينات المضادة ل ATO إلى الخلايا العقدية الشبكية المصابة أو شبكية العين لاستهداف شبكية العين على مستوى العالم.

يتم تجميع جهاز الحقن داخل العين واستخدامه لحقن المواد في الغرفة الزجاجية للعين لاستهداف الخلايا العقدية الشبكية على وجه التحديد. إما يتم وضع الجلرغوم أو استخدام محاقن هاميلتون لحقن المواد في العصب البصري. تشير نتائج تصوير الجذع إلى أنه يمكن زيادة بقاء الخلايا العقدية الشبكية عن طريق توصيل العوامل المضادة لموت الخلايا المبرمج.

باستخدام هذه التقنيات ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد البروتينات التي تشارك في موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية البالغة في الجهاز العصبي المركزي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أمراض الجهاز العصبي المركزي لأن قطع العصب البصري هو نموذج قابل للتكرار لموت الخلايا المبرمج العصبي في الجهاز العصبي المركزي للبالغين بشكل عام ، يكافح الجدد في هذه التقنية لأنهم يتضررون من العدسة عند إدخال الماصة الزجاجية في الغرفة الزجاجية للعين. لتحضير نظام الحقنة للحقن داخل العين ، ابدأ بإزالة أي إبرة أو صمولة RN.

موجود على حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر rn ضيقة 1701. أدخل PFA الوحشي في ذروة الكوب الوحشي لتركيب الضغط. ثم أدخل التركيب الكامل في نهاية المحقنة وقم بربط صامولة RN بشكل غير محكم فوق الجزء العلوي.

أدخل أحد طرفي أنبوب الذروة مقاس 16 بوصة في تركيب الضغط من خلال الفتحة الموجودة في صامولة RN. تأكد من أن أنبوب الذروة في مكان كامل. شد صامولة RN لضغط الوحشي ، مما سيغلق أنبوب الذروة.

كرر هذه العملية على طرفي قارنة التوصيل الزجاجية RN المزدوجة. قم بتوصيل الطرف الحر لأنبوب الذروة بأحد طرفي قارنة التوصيل الزجاجية RN المزدوجة عن طريق شد صامولة RN. ستشكل الماصة الزجاجية الدقيقة الإبرة والبرميل لنظام الحقن.

أدخل الماصة الزجاجية في الطرف الحر لمقرنة التوصيل الزجاجية RN المزدوجة. شد صامولة RN لتثبيت الماصة في مكانها. تحت مجهر تشريح ، قم بإنشاء طرف بالقطر المناسب عن طريق إمساك ماصة صغيرة مسحوبة بزاوية وفرك الطرف على طول الزينة الزجاجية للشريحة الزجاجية لإحداث كسر.

من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الطرف النهائي مشطوفا قليلا. بعد ذلك ، باستخدام مجموعة تحضير من شركة Hamilton Syringe Company مملوءة بالحقنة ، ورابط أنابيب الذروة ، ومقرنة التوصيل الزجاجية RN المزدوجة ، والماصة الزجاجية الدقيقة بالزيت المعدني للاستخدام. باستخدام نظام الحقن الهيدروليكي ، استبدل الإبرة بإبرة هاميلتون 9 0 0 3 0.

بعد ذلك ، ضع حاجزا مطاطيا فوق إبرة هاميلتون 9 0 0 3 0 لتوفير ختم أثناء حقن الزيت المعدني. أدخل إبرة هاميلتون 9 0 0 3 0 من حقنة التحضير في الجزء الخلفي من برميل حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر لنظام الحقن. اضغط على الحاجز بإحكام على نهاية المحقنة لإنشاء ختم.

ببطء على المكبس سوف يمر الزيت المعدني عبر العناصر الزجاجية لنظام الحقن. ملء الماصة الزجاجية. ادفع كل الزيت من خلال نظام الحقن لإزالة أي فقاعات هواء على طول المسالك.

الزيت المعدني من حقنة التعبئة ، اسحب الإبرة ببطء أثناء توزيع الزيت باستمرار. لمنع تكوين فقاعة الهواء ، أعد ملء حقنة التحضير وحقنها مرة أخرى. عندما يمتلئ النظام بأكمله بالزيت المعدني ، أدخل المكبس الأصلي ل 10 ميكرولتر.

حقنة هاميلتون تضغط تماما على المكبس لإزالة الزيوت المعدنية الإضافية من النظام. امسح الماصة الزجاجية الدقيقة ونهاية المحقنة نظيفة. مع 70٪ من الإيثانول ، اسحب المكبس إلى علامة الميكرولتر على البرميل.

ستمتلئ نهاية الماصة الزجاجية الدقيقة بالهواء، مما يوفر منطقة عازلة بين الزيت المعدني والسائل المراد حقنه. املأ برميل الماصة عن طريق وضع طرف الماصة الدقيقة في المحلول المطلوب وسحب مكبس حقنة هاميلتون. لن يتم حقن أكثر من أربعة إلى خمسة ميكرولترات من المحلول في عين الفئران البالغة لإجراء الحقن داخل العين.

ابدأ بتبديل تدفق الغاز إلى ملحق قناع الغاز للإطار التجسيمي. ثم ضع فأر مخدر بالفلور في الجهاز التجسيمي. اخفض تركيز الفلور إلى 2٪ وراقب التخدير.

قم بتغطية ببطانية جراحية. للحفاظ على درجة حرارة الجسم طوال الجراحة ، افتح الجفون وضع قطرة واحدة من محلول مخدر الأكان. على سطح حقن القرنية يتطلب شخصين، أحدهما لإدخال الماصة الزجاجية في الغرفة الزجاجية والحفاظ على موضع الماصة.

وآخر للضغط على المكبس على المحقنة ، والذي يوفر الحل المطلوب. تحت المجهر الجراحي ، أمسك الماصة الزجاجية الدقيقة ومقرنة زجاج RN المزدوجة ، وانشر الجفون لتشكيل شكل V مقابل موقع الحقن بالأصابع ، سترتفع العين خارج المدار. أدخل طرف الماصة الدقيقة الزجاجية برفق من خلال منطقة خالية من الأوعية الدموية ومن خلال الصلبة بزاوية هبوطية.

عندما تخترق الماصة الصلبة ، سيشعر بفرقعة صغيرة. يجب على الشخص الذي يحمل المحقنة الآن حقن أربعة ميكرولترات من المحلول عن طريق الضغط على المكبس على علامة الميكرولتر على المحقنة. يجب أن يستغرق الحقن حوالي ثانية إلى ثانيتين.

سوف يتدفق المحلول المحقون بنجاح عبر الغرفة الزجاجية ، ويحافظ على ثبات الماصة الدقيقة لمدة خمس ثوان تقريبا ، ثم ينسحب في نفس الاتجاه عندما تم إدخال الإبرة ، سترفرف الملتحمة مرة أخرى فوق الفتحة الصغيرة ، مما يساعد على إغلاق البزل الصلبي. بمجرد اكتمال الجراحة ، قم بإيقاف تشغيل الفلور واسمح للحيوان باستنشاق الأكسجين لعدة دقائق. قم بتغطية سطح القرنية بمرهم العين العيون من أجل منع جفاف القرنية أثناء الشفاء ، ثم قم بإزالة من الجهاز التجسيمي وإعادته إلى قفص الاسترداد.

لمعالجة خلايا العقدة الشبكية من خلال النقل الرجعي بعد استئصال الأذن السابق. قم أولا بإجراء عملية قطع العصب البصري وفقا للتعليمات الواردة في بروتوكول قطع العصب البصري بالفيديو المصاحب ، 2 ، 2 ، 4 ، 1 أدوية التتبع. يمكن تطبيق البلازميدات أو siRNAs أو النواقل الفيروسية على جذع العصب البصري.

هناك طريقتان رئيسيتان لإنجاز هذا الإجراء باستخدام رغوة الجل أو الحقن المباشر في العصب البصري. إذا تم استخدام طريقة رغوة الهلام ، فتأكد من أن خلايا العقدة الشبكية قد تم تصنيفها مسبقا عن طريق حقن متتبعات التتبع الرجعية في القولون العلوي قبل أسبوع واحد من التصنيف. مباشرة بعد قطع العصب البصري ، توضع قطعة صغيرة من رغوة الجل مبللة في المحلول التجريبي فوق جذع العصب البصري المنقول ، ثم يتم إرجاع محتويات المدار إلى الموقع السابق.

عندما يتم إرجاع العين إلى وضع محايد ، استخدم ملقطا لدفع قطعة رغوة الجل لأسفل في المدار ، مع ضمان بقائها فوق نهاية العصب البصري. تعتبر تقنية الحقن أكثر فاعلية لتوصيل المواد التي يجب أن تصل إلى سيتوبلازم المحور العصبي من أجل نقلها إلى حد كبير عن طريق التدفق البلازمي المرجعي ، يتم استخدام حقنة هاميلتون ضيقة سعة 10 ميكرولتر لحقن المحلول المطلوب في العصب البصري المنقول. من المستحسن استخدام إبرة ذات شطبة قصيرة.

قم بتحميل المحقنة ب 10 ميكرولتر من المحلول المراد حقنه. عادة ما تكون بلازميدات إيرنا أو ناقلات فيروسية لحقن قبضة حافة العصب البصري بملقط دومون رفيع الطرف. أدخل نهاية الإبرة في العصب البصري بالتوازي مع العصب.

حتى يصبح الشطبة غير مرئية ، سيتم تغليف الإبرة التي تم إدخالها من جميع الجوانب بواسطة العصب. بمجرد إدخال الإبرة ، اضغط برفق على جانبي العصب باستخدام ملقط الطرف الدقيق وحقن ربع المحلول أثناء تدوير المحقنة. ربع دورة في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة.

استمر في تكرار هذه الخطوات حتى يتم الانتهاء من الدوران الكامل للإبرة وحقن محتويات المحقنة بالكامل. قم بإزالة طرف المحقنة من العصب. اترك أي سائل محقون به ارتداد من العصب داخل المدار لأن هذا سيشكل بركة إضافية لامتصاصها بواسطة نهايات المحاور.

أعد المحتويات المدارية إلى وضعها الأصلي ، وأغلق الجرح واترك يتعافى. يجب إيواء بشكل مستقل بعد الجراحة. يجب إعطاء مسكنات ما بعد الجراحة وفقا لإرشادات رعاية حيوانك.

يجب مراقبة السلطات بعناية بعد الجراحة. كما هو موضح في هذا الفيديو ، يمكن استهداف RGC بشكل مباشر عن طريق توصيل الببتيدات أو الأدوية أو النواقل أو البلازميدات أو siRNAs إلى جذع العصب البصري المنقول. في هذا المثال التمثيلي ، تم إجراء وضع العلامات على الذهب الفلوري وحقن ثلاثة ببتيدات مصنفة في النظام الدولي للوحدات على الفور في العصب البصري.

ثم تم إجراء التصوير الحي لشبكية العين من أجل منع الببتيدات من التسرب من الأنسجة أثناء التثبيت ، كما يتضح هنا ، كانت الببتيدات الثلاثة المسماة بالمعهد الدولي للوقود التي يتم حقنها في العصب البصري رجعية ، وتم نقلها بشكل كبير إلى RGC somato في شبكية العين. في هذا المثال ، تم حقن SI ثلاثة siRNAs المسماة في جذع العصب البصري. مباشرة بعد إجراء التصنيف والتصوير الحي لشبكية العين مرة أخرى ، تم إرجاع ثلاثة siRNAs مصنفة في العصب البصري ، وتم نقلها بواسطة RG CS كما يتضح من توسيطها.

مع وضع العلامات الرجعية على الفلورجولد بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في ثوان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم توخي الحذر لتجنب إتلاف العدسة. لا تنس أن العمل مع الجسيمات الفيروسية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتباع الإرشادات المؤسسية للعمل مع المخاطر البيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.