أساليب التلاعب التجريبية بعد Transection العصب البصري الثدييات في الجهاز العصبي المركزي

تُعد الخلايا العقدية الشبكية (RG cs) عصبونات في الجهاز العصبي المركزي تقوم بنقل المعلومات البصرية من الشبكية إلى الدماغ عبر العصب البصري. وقد تم استعراض طريقة في الفيديو المصاحب لقطع المحاور العصبية (ex sodomizing) لجميع الخلايا العقدية الشبكية كنموذج للموت الخلوي المبرمج في الجهاز العصبي المركزي لدى البالغين. يتم هنا دمج هذه الطريقة مع إجراءات تستهدف مباشرةً عوامل التغذية العصبية، أو الحمض النووي الريبوزي المتداخل القصير (siRNAs)، أو البلازميدات، أو النواقل الفيروسية التي تشفر البروتينات المضادة لـ ATO، وتوجيهها إلى الخلايا العقدية الشبكية المصابة أو إلى الشبكية لاستهداف الشبكية بشكل كلي.

يتم تجميع جهاز حقن داخل العين واستخدامه لحقن المواد في الغرفة الزجاجية للعين لاستهداف الخلايا العقدية الشبكية بشكل محدد. يتم إما وضع Gelfoam أو استخدام محاقن Hamilton لحقن المواد في العصب البصري. وتشير نتائج تصوير الجذع إلى أنه يمكن زيادة بقاء الخلايا العقدية الشبكية عن طريق إيصال عوامل مضادة لموت الخلايا المبرمج.

باستخدام هذه التقنيات، يمكن توظيف هذه الطريقة لتحديد البروتينات المشاركة في موت الخلايا العصبية المبرمج في الجهاز العصبي المركزي للبالغين. وتمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أمراض الجهاز العصبي المركزي، لأن قطع العصب البصري يعد نموذجاً قابلاً للتكرار لموت الخلايا العصبية المبرمج في الجهاز العصبي المركزي للبالغين. وبشكل عام، يواجه المبتدئون في هذه التقنية صعوبة بسبب إتلاف العدسة عند إدخال الماصة الزجاجية في الغرفة الزجاجية للعين. ولتحضير نظام الحقنة للحقن داخل العين، ابدأ بإزالة أي إبرة أو صامولة RN.

قم بالتحضير باستخدام محقنة Hamilton 1701 بسعة 10 µL ذات إحكام غازي. أدخل حلقة PFA في حلقة كوب الذروة الخاصة بوصلة الضغط. ثم أدخل الوصلة الكاملة في نهاية المحقنة واربط صامولة RN فوقها بشكل فضفاض.

أدخل أحد طرفي أنبوب PEEK بقطر 1/16 بوصة في وصلة الضغط عبر الفتحة الموجودة في صامولة RN. تأكد من استقرار أنبوب PEEK في مكانه تماماً. أحكم ربط صامولة RN لضغط الحلقة المعدنية (ferrule)، مما سيؤدي إلى إحكام سد أنبوب PEEK.

كرر هذه العملية على كلا طرفي قارنة الزجاج المزدوجة من نوع RN. قم بتوصيل الطرف الحر لأنبوب الذروة بأحد طرفي قارنة الزجاج المزدوجة من نوع RN عن طريق إحكام ربط صامولة RN. ستشكل الماصة الزجاجية الدقيقة الإبرة والأسطوانة لنظام الحقن.

أدخل الماصة الزجاجية في الطرف الحر من قارن RN الزجاجي المزدوج. أحكم ربط صامولة RN لتثبيت الماصة في مكانها. وباستخدام مجهر تشريحي، قم بتشكيل طرف بالقطر المناسب عن طريق إمساك الماصة الدقيقة المسحوبة بزاوية معينة وفرك طرفها على السطح المطفي لشريحة زجاجية لإحداث كسر.

من الناحية المثالية، يجب أن تكون الطرف النهائية مشطوفة قليلاً. بعد ذلك، وباستخدام مجموعة تحضير من شركة Hamilton Syringe Company، يتم ملء المحقنة، ووصلة أنبوب الذروة، ووصلة الزجاج المزدوجة لـ RN، والماصة الزجاجية الدقيقة بالزيت المعدني لاستخدامها. وفي نظام الحقن الهيدروليكي، استبدل الإبرة بإبرة Hamilton 9 0 0 3 0.

بعد ذلك، ضع سدادة مطاطية فوق إبرة Hamilton 9 0 0 3 0 لتوفير سد محكم أثناء حقن الزيت المعدني. أدخل إبرة Hamilton 9 0 0 3 0 الموجودة في سرنجة التجهيز في الجزء الخلفي من أسطوانة سرنجة Hamilton سعة 10 µL الخاصة بنظام الحقن. اضغط السدادة بإحكام مقابل نهاية السرنجة لإنشاء سد محكم.

اضغط على المكبس ببطء ليمر الزيت المعدني عبر العناصر الزجاجية لنظام الحقن، مما يؤدي إلى ملء الماصة الزجاجية. ادفع كل الزيت عبر نظام الحقن لإزالة أي فقاعات هوائية على طول المسار.

إذا نفد الزيت المعدني من سرنجة الملء، اسحب الإبرة ببطء مع الاستمرار في توزيع الزيت. ولمنع تكون فقاعات الهواء، أعد ملء سرنجة التحضير وقم بالحقن مرة أخرى. وعندما يمتلئ النظام بالكامل بالزيت المعدني، أدخل المكبس الأصلي لسعة 10 microliter.

باستخدام محقنة Hamilton، اضغط المكبس بالكامل لإزالة أي زيت معدني إضافي من النظام. امسح الماصة الزجاجية الدقيقة وطرف المحقنة جيداً. باستخدام إيثانول 70%، اسحب المكبس حتى علامة 2 µL على أسطوانة المحقنة.

سيمتلئ طرف الماصة الزجاجية الدقيقة بالهواء، مما يوفر منطقة عازلة بين الزيت المعدني والسائل المراد حقنه. املأ أنبوب الماصة بوضع طرف الماصة الدقيقة في المحلول المطلوب وسحب مكبس حقنة Hamilton. لن يتم حقن أكثر من 4 إلى 5 µL من المحلول في عين جرذ بالغ لإجراء الحقن داخل العين.

ابدأ بتحويل تدفق الغاز إلى ملحق قناع الغاز الخاص بالإطار التجسيمي. ثم ضع جرذاً مخدراً بـ isof fluorine في جهاز التجسيم. خفّض تركيز isof fluorine إلى 2% وراقب حالة التخدير.

قم بتغطية الحيوان ببطانية جراحية. وللحفاظ على درجة حرارة الجسم طوال فترة الجراحة، افتح الجفون وضع قطرة واحدة من محلول تخدير. يتطلب الحقن على سطح القرنية وجود شخصين، أحدهما لإدخال الماصة الزجاجية في الغرفة الزجاجية والحفاظ على وضعية الماصة.

وأخرى لضغط مكبس المحقنة التي تقوم بإيصال المحلول المطلوب. وباستخدام مجهر جراحي، أمسك بالماصة الزجاجية الدقيقة ووصلة RN الزجاجية المزدوجة، ثم باعد بين الجفنين لتشكيل شكل V مقابل موقع الحقن؛ وبواسطة الأصابع، ستبرز العين خارج المحجر. أدخل طرف الماصة الزجاجية الدقيقة برفق في منطقة خالية من الأوعية الدموية ومن خلال الصلبة بزاوية مائلة للأسفل.

عندما تخترق الماصة الصلبة، سيُشعر بفرقعة صغيرة. يجب على الشخص الذي يمسك بالحقنة الآن حقن 4 µL من المحلول عن طريق ضغط المكبس وصولاً إلى علامة 2 µL على الحقنة. يجب أن تستغرق عملية الحقن من ثانية إلى ثانيتين تقريباً.

سيتدفق المحلول المحقون بنجاح عبر الغرفة الزجاجية، لذا ثبت الماصة الدقيقة لمدة خمس ثوانٍ تقريباً، ثم اسحبها في نفس اتجاه إدخال الإبرة، حيث ستعود الملتحمة لتغطي الفتحة الصغيرة، مما يساعد في سد ثقب الصلبة. وبمجرد اكتمال الجراحة، أوقف تشغيل isof fluorine واسمح للحيوان بتنفس الأكسجين لعدة دقائق. ضع مرهم العين العيني على سطح القرنية لمنع جفافها أثناء فترة التعافي، ثم أخرج الحيوان من الجهاز التجسيمي وأعده إلى قفص التعافي.

للتلاعب بالخلايا العقدية الشبكية عن طريق النقل الرجعي بعد استئصال العين. قم أولاً بإجراء قطع للعصب البصري وفقاً للتعليمات الواردة في الفيديو المصاحب لبروتوكول قطع العصب البصري، 2، 2 4، 1 من الكواشف الدوائية. يمكن تطبيق البلازميدات، أو الـ siRNAs، أو النواقل الفيروسية على جذع العصب البصري.

هناك طريقتان رئيسيتان لإتمام هذا الإجراء باستخدام إسفنج الجل (gel foam) أو الحقن المباشر في العصب البصري. في حال استخدام طريقة إسفنج الجل، يجب التأكد من وضع علامات مسبقة على خلايا العقد الشبكية عن طريق حقن المتتبعات الارتجاعية في الأكيم العلوي قبل أسبوع واحد من التصنيف. ومباشرة بعد قطع العصب البصري، توضع قطعة صغيرة من إسفنج الجل المغموس في المحلول التجريبي فوق جذع العصب البصري المقطوع، ثم تُعاد محتويات المحجر إلى موقعها السابق.

عندما تعود العين إلى وضعها المحايد، استخدم الملقط لدفع قطعة الإسفنج الهلامي إلى أسفل في المحجر، مع التأكد من بقائها فوق طرف العصب البصري. وتعتبر تقنية الحقن أكثر فعالية لإيصال المواد التي يجب أن تصل إلى سيتوبلازم المحوار لكي يتم نقلها تراجعياً عبر التدفق السيتوبلازمي. تُستخدم حقنة Hamilton بسعة 10 µL محكمة الإغلاق لحقن المحلول المطلوب في العصب البصري المقطوع. ويُفضل استخدام إبرة ذات شطب قصير.

املأ المحقنة بـ 10 µL من المحلول المراد حقنه. وعادةً ما تكون هذه المحاليل عبارة عن بلازميدات irna أو ناقلات فيروسية للحقن. أمسك حافة العصب البصري باستخدام ملقط dumont دقيق السن. أدخل طرف الإبرة في العصب البصري، بحيث تكون موازية للعصب.

ستكون الإبرة المدخلة محاطة بالعصب من جميع الجوانب حتى لا يعود الشطب مرئياً. وبمجرد إدخال الإبرة، اضغط برفق على جانبي العصب باستخدام ملقط دقيق الرأس واححقن ربع المحلول مع تدوير المحقنة. قم بتدويرها ربع دورة إما باتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة.

استمر في تكرار هذه الخطوات حتى تكتمل دورة كاملة للإبرة ويتم حقن كافة محتويات السرنجة. اسحب رأس السرنجة من العصب. اترك أي سائل محقون قد ارتجع من العصب داخل المحجر، حيث س يشكل هذا تجمعاً إضافياً لامتصاصه بواسطة نهايات المحاور العصبية.

أعِد محتويات الحجاج إلى موضعها الأصلي، ثم أغلق الجرح واترك الحيوان ليتعافى. يجب إيواء الحيوانات بشكل منفرد بعد الجراحة. كما ينبغي إعطاء المسكنات بعد الجراحة وفقاً لإرشادات رعاية الحيوان المتبعة لديك.

يجب مراقبة السلطات والحيوانات بعناية بعد الجراحة. وكما هو موضح في هذا الفيديو، يمكن استهداف RGC مباشرة عن طريق إيصال الببتيدات أو الأدوية أو النواقل أو البلازميدات أو siRNAs إلى جذع العصب البصري المقطوع. في هذا المثال التمثيلي، تم إجراء وسم تراجعي باستخدام fluoro gold وحُقنت الببتيدات الموسومة بـ SI three فوراً في العصب البصري.

تم إجراء التصوير الحي للشبكية بعد ذلك لمنع تسرب الببتيدات من النسيج أثناء التثبيت، وكما يظهر هنا، فإن الببتيدات الموصومة بـ SI three والتي تم حقنها في العصب البصري قد نُقلت تراجعياً بشكل كبير إلى أجسام خلايا الـ RGC في الشبكية. في هذا المثال، تم حقن siRNAs الموصومة بـ SI three في جذع العصب البصري. ومباشرة بعد عملية قطع المحور العصبي وإجراء التصوير الحي للشبكية مرة أخرى، تبين أن siRNAs الموصومة بـ SI three المحقونة في العصب البصري قد نُقلت تراجعياً بواسطة RG CS كما يشير تموضعها المشترك.

بمجرد إتقان تقنية الوسم التراجعي باستخدام Fluoro-Gold، يمكن تنفيذها في ثوانٍ معدودة إذا تم القيام بها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر لتجنب إتلاف العدسة. ولا تنسَ أن العمل مع الجزيئات الفيروسية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتباع الإرشادات المؤسسية الخاصة بالتعامل مع المخاطر البيولوجية عند تنفيذ هذا الإجراء.