ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

تقليديا ، تم إجراء الدراسات البيولوجية والسريرية التي تتطلب تحليلا مجهريا بدقة على المستوى الخلوي عن طريق إجراء تجارب متعددة بالتوازي مع العينات الفردية التي تمت إزالتها من الدراسة في الوقت المتسلسل للتقييم بواسطة المجهر الضوئي ، في حين أن الفحص المجهري الكونفوكالي والمتعدد الفوتون والمجهر التوافقي الثاني كلها تقنيات مفيدة للتصوير في الموقع. البنية التحتية المطلوبة معقدة ومكلفة تتضمن أنظمة الليزر المسح ومصادر الضوء المعقدة. نوضح هنا كيفية بناء نظام منظار دقيق عالي الدقة للألياف البصرية في يوم واحد ، باستخدام مكونات الرف بأقل من 5 ، 000 دولار أمريكي.

توفر المنصة المرونة من حيث دقة الصورة ومجال الرؤية والطول الموجي للتشغيل. أولا ، يتم تجميع إطار مجهر مضان epi بسيط لاستيعاب عدسات المرشحات الضوئية لمصدر الضوء ، وحزمة الألياف البصرية ، وكاميرا CCD. بعد ذلك ، يتم تثبيت عدسات التصوير ، والتي تشكل صورة مكبرة لحزمة الألياف الضوئية على كاميرا CCD.

ثم يتم تثبيت مصدر LED مع بصريات الإضاءة من أجل توفير ضوء إثارة الفلورسنت للعينة. أخيرا ، باستخدام المنظار المجهري المجمع ، يكشف التصوير في الوقت الفعلي عن تفاصيل المستوى الخلوي للعينات المصنفة بالفلورسنت ، بما في ذلك الثقافات المختبرية ، والنماذج الحيوانية في الجسم الحي ، والموضوعات البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر أو متعدد الفوتون ، هي أنها بسيطة وغير مكلفة بما فيه الكفاية بحيث يمكن للباحثين العاملين في مجموعة متنوعة من المجالات تنفيذها بسرعة وتخصيصها لتلبية احتياجاتهم الخاصة.

يجب اعتبار المنظار الدقيق عالي الدقة الموصوف هنا بمثابة تكوين أساسي مع العديد من الاختلافات الممكنة في التجميع والتطبيق. عند اختيار المكونات لتطبيق معين ، ضع في اعتبارك العلاقات المتأصلة في الفحص المجهري الفلوري بين تركيز الفلورول ، وإضاءة التبييض الضوئي ، والكثافة ، وحساسية الكاميرا ، والكسب ، ووقت التعرض. تم تصميم هذه المنصة لاستخدامها مع برو فلافين كعامل تباين فلوري ، ولكن يمكن تهيئتها للعمل مع أصباغ الفلورسنت الأخرى.

برو فلافين عبارة عن صبغة نواة ساطعة ذات أطوال موجية ذروة امتصاص وانبعاث تبلغ 445 نانومتر و 515 نانومتر على التوالي. سيتطلب استخدام عوامل التباين الأخرى من المستخدم تحديد انبعاث الإثارة ، وتبدأ المرشحات ثنائية اللون بشكل مناسب لتجميع نظام المنظار الداخلي الدقيق عن طريق توصيل قضيبين من القفص بطول 1.5 بوصة لتشكيل زوج من قضبان بطول 7.5 بوصة. قم بربط القضبان في وجه واحد لوحدة المرآة القابلة للطي ، ثم قم بتثبيت مرآة قطرها بوصة واحدة.

بعد ذلك ، قم بربط أربعة قضبان مقاس 0.5 بوصة في الوجه المقابل لوحدة المرآة القابلة للطي. حرك مكعب القفص على قضبان القفص مقاس 7.5 بوصة عبر الفتحتين السفليتين. قم بربط قضبان بوصتين في الوجه الجانبي لمكعب القفص.

باستخدام حامل C لمحول SM واحد ، قم بتوصيل الكاميرا بلوحة قفص. قم بتأمين لوحة القفص على قضبان القفص مقاس 0.5 بوصة المتدفقة مع وجه وحدة المرآة القابلة للطي. حدد عدسة أنبوبية قطرها بوصة واحدة لتشكيل صورة لحزمة الألياف الضوئية على الكاميرا.

يجب تحديد البعد البؤري للعدسة بحيث يتم أخذ عينات من سبب حزمة الألياف الضوئية بمقدار بكسلين على الأقل. عند التصوير على الكاميرا، أدخل العدسة في أنبوب عدسة بطول ثلاثة بوصات وقم بتأمين العدسة بحلقة احتجاز. مفتاح ربط مفيد في شد الحلقات والاحتفاظ بها في أنابيب العدسة الطويلة.

قم بإسقاط مرشح الانبعاث في أنبوب العدسة مقاس 3 بوصات أعلى حلقة التثبيت الأولى وأضف حلقة أخرى لتثبيت الفلتر في مكانه. تأكد من أن اتجاه المرشح يفي بالاصطلاح المشار إليه من قبل الشركة المصنعة للمرشح. قم بربط أنبوب العدسة في جانب مكعب القفص الأقرب إلى كاميرا CCD.

يظهر هذا الموقف هنا أيضا. لاحظ أنه في الرسم التخطيطي ، تظهر هذه العدسة والمرشح بدون أنبوب عدسة بثلاث بوصات. للوضوح ، قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر وعرض الصورة على الشاشة.

قم بتوجيه مجموعة القفص إلى جسم بعيد وحرك مكعب القفص على طول القضبان حتى تظهر صورة للكائن في بؤرة التركيز. استخدم مفك البراغي لتشديد البراغي الأربعة الموجودة على جانبي مكعب القفص. تمسك هذه البراغي بالقضبان عند إحكام ربطها بتثبيت المكعب في موضعه.

سيضمن ذلك أن العدسات الأنبوبية ستشكل صورة مركزة لحزمة الألياف على الكاميرا عند دمجها مع العدسة الموضوعية المصححة اللانهائية. بعد ذلك ، أدخل المرآة الثنائية في الحامل وضعها عند 45 درجة في مكعب القفص. قم بربط العدسة الموضوعية عبر محول خيط واحد من RMS إلى SM وأنبوب عدسة قابل للتعديل في وجه مكعب القفص المقابل لحامل عدسة الأنبوب.

بعد ذلك ، قم بربط موصل SMA في لوحة قفص وقم بتثبيته على القضبان تقريبا على مسافة العمل للعدسة الموضوعية. أضف لوحة القاعدة والغطاء النهائي إلى الجوانب المفتوحة لمكعب القفص. ثم قم بتركيب مصباح LED على لوحة قفص وحركها في نهاية قضبان بوصتين.

أضف عدسة إلى أنبوب عدسة مقاس 0.5 بوصة بحيث عندما يتم تثبيت هذا الأنبوب في جانب مكعب القفص ، فإنه سيشكل صورة لمؤشر LED يملأ الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية. أيضا ، أضف مرشح الإثارة إلى أنبوب العدسة. في هذه المرحلة ، يمكن استخدام برنامج تشغيل LED للتحكم في شدة الضوء المضيء باستخدام الإيبوكسي.

قم بتوصيل موصل SMA لألياف 1030 ميكرون بحزمة الألياف البصرية لمجال الرؤية 720 ميكرون. للحصول على تفاصيل حول توصيل الألياف البصرية ، راجع مختبرات T Thor ، رقم الجزء FN تسعة ستة. دليل لتوصيل وتلميع الألياف الضوئية.

قم بربط حزمة عيون موصل SMA في وعاء SMA المثبت على قضبان القفص ، وتوجيه الطرف البعيد للحزمة نحو مصدر ضوء عريض النطاق ، وستكون إضاءة الفلورسنت كافية. ثم لاحظ صورة الوجه القريب للحزمة على كاميرا CCD. أخيرا ، اضبط موضع العدسة الموضوعية عن طريق شد مكعب القفص أو إخراجه.

حتى تظهر صورة حزمة الألياف في بؤرة التركيز ، يجب أن يكون السبب الفردي مرئيا بوضوح. يمكن زيادة الدقة المكانية للمنظار المجهري عن طريق ربط عدسة دقيقة أو مجموعة عدسة بالطرف البعيد لحزمة الألياف. يتم تكوين هذه البصريات بحيث بدلا من وضع طرف الحزمة مباشرة على الأنسجة ، يتم تصوير الطرف على سطح الأنسجة بتكبير dem.

وبالتالي زيادة تردد أخذ العينات المكاني الذي يفرضه السبب التوجيهي للضوء لحزمة الألياف. تتوافق درجة التكبير مع الزيادة في الدقة المكانية وفي نفس الوقت ، مع انخفاض متناسب في مجال الرؤية. حدد عدسة ابتسامة مع التكبير المطلوب ومسافة العمل لتطبيقك.

تأكد من تطابق قطر العدسة مع قطر حزمة الألياف. أنت تخطط للعمل معها. قم بتركيب حزمة الألياف وعدسة الابتسامة على مراحل منفصلة لتحديد المواقع يدويا ثلاثية المحاور تحت مجهر منخفض الطاقة أو مجسم لمحاذاة دقيقة.

بعد ذلك ، ضع قطرة من المادة اللاصقة البصرية على العدسة أو وجه الحزمة. باستخدام محددات الموضع اليدوية ، قم بتوصيل المكونين. قم بتعريض الواجهة للأشعة فوق البنفسجية للجرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لعلاج المادة اللاصقة.

لحماية عدسة الابتسامة والواجهة المستعبدة ، استخدم طولا قصيرا من الأنابيب الشعرية المصنوعة من الألومنيوم لإحاطة المفصل. حرك الأنبوب فوق المفصل وثبته في مكانه مع قطرة الايبوكسي في كل طرف من طرفي الأنبوب ، واستخدم أنابيب الانكماش الحراري لإنهاء التجميع. قبل التصوير بالمنظار المجهري ، قم بتطبيق عامل التباين على الخلايا أو الأنسجة المراد تصويرها على خلايا الصورة والثقافة.

أولا ، قم بإزالة وسائط النمو عن طريق peppe. ثم أضف محلول الفلافين الاحترافي عن طريق سحب العينة برفق في البئر. بعد حضانة قصيرة تصل إلى دقيقة واحدة ، قم بإزالة محلول pro flavin بواسطة peppe وتخلص منه.

شطف الخلايا عن طريق إضافة وإزالة محلول PBS جديد إلى التثبيت جيدا على الطرف البعيد لحزمة الألياف في تركيبات آمنة مع مراحل تحديد المواقع اليدوية على المحور x و Y و Z لتحقيق الاستقرار. أثناء التصوير بعد تطبيق الصبغة على الخلايا أو الأنسجة ، ضع حزمة الألياف الضوئية في ملامسة الضوء للعينة. اعرض صورة حزمة الألياف الضوئية على شاشة الكمبيوتر ، إما باستخدام البرنامج المقدم من الشركة المصنعة للكاميرا أو أي برنامج مخصص قد ترغب في تطويره.

اضبط وقت التعرض وإعدادات الكسب للكاميرا للحصول على صورة ذات سطوع مقبول. عند تجميعه بشكل صحيح ، سيعمل المنظار الدقيق كمجهر مضان epi يتم نقله من خلال حزمة ألياف بصرية متماسكة. للحصول على أفضل نتائج التصوير ، يجب الانتباه لضمان استيفاء ثلاثة شروط رئيسية.

أولا ، يجب تصوير الوجه القريب لحزمة الألياف على كاميرا CCD دون إلغاء التركيز من أجل تحقيق الدقة الكاملة للنظام. هنا. يتم تصوير جزء من حزمة الألياف بتركيز ضعيف وتركيز خفيف وتركيز جيد. يتم العثور على التركيز البؤري الأمثل عن طريق ضبط الموضع الفعلي للعدسة الشيئية بالنسبة لوجه الحزمة.

ثانيا ، يجب إضاءة الوجه القريب لحزمة الألياف بشكل موحد على قطرها الكامل. كما هو موضح سابقا ، يتم تحقيق ذلك من خلال تكوين بصريات الإضاءة لإضاءة الكولا. تم الحصول على الصورة الموضحة هنا عندما تضيء عينة فلورية موحدة في هذا التكوين المفضل.

النتيجة المقابلة تحت الإضاءة الحرجة هنا. يتم تصوير هيكل LED على وجه حزمة الألياف مما يؤدي إلى ظهور هذا النمط غير المرغوب فيه المتراكب على هيكل العينة الحقيقي. ثالثا ، من المهم التأكد من أن كل من الوجوه القريبة والبعيدة لحزمة الألياف يجب أن تكون نظيفة وخالية من الخدوش والرقائق.

في هذا المثال، يتم إرفاق حطام الصورة بوجه الحزمة ويظهر التلف على شكل شريحة صغيرة عند موضع الساعة الخامسة على محيط الألياف. يمكن إزالة الحطام من وجوه الحزمة عن طريق التنظيف بنفس طريقة موصلات الألياف البصرية التقليدية باستخدام ورق العدسة والأيزوبروبانول أو أدوات تنظيف الألياف البصرية القياسية. تم تصنيف 1483 خلية ب Pro Flavin وتم وضع حزمة الألياف العارية برفق على العينة.

يظهر التصوير في المختبر هنا عندما تم ربط عدسة ابتسامة 2.5 × بطرف الحزمة ، وتم تحقيق تحسن في الدقة المكانية وتقليل مجال الرؤية. في الجسم الحي التصوير الذي تم فيه تمرير حزمة ألياف بقطر خارجي 0.5 ملم من خلال إبرة قياس 21 وتم تطويرها إلى أنسجة وسادة دهنية ثديية للفأر كما هو موضح في هذا الفيلم ، والخلايا الشحمية مرئية بوضوح مع الحركة بسبب الدورة القلبية. في هذا المثال ، تم إجراء تصوير الغشاء المخاطي للفم في متطوع بشري سليم باستخدام حزمة ألياف أكبر بقطر خارجي 1.5 ملم.

في جميع الأمثلة ، تم استخدام pro flavin المعروض كعامل تباين فلوري نووي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتجميع منظار ألياف بصرية مجهري للتصوير الفلوري للخلايا والأنسجة.