وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير طعوم كبدية منزوعة الخلايا باستخدام مصفوفة كبد منزوعة الخلايا. ويتم تحقيق ذلك من خلال تركيب القثطرة أولاً في كبد متبرع، ثم يتم نزع الخلايا من العضو عن طريق التروية بسلسلة من المحاليل المنظفة.

تُجرى بعد ذلك عملية إعادة التوعي لمصفوفة الكبد منزوعة الخلايا عن طريق إدخال خلايا كبدية أولية بالغة بواسطة التروية. وأخيرًا، يُستخدم نظام تروية في المختبر لاستزراع طعم الكبد المُخلوي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر الوظيفة الكبدية للطعوم المعاد تحجيمها في المختبر من خلال قياس إفراز الألبومين واليوريا وحمض الصفراوي الكلي في وسط التروية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالوسائل المتاحة حاليًا، مثل تصنيع السقالات باستخدام المواد الحيوية الاصطناعية وتقنيات هندسة الأنسجة التقليدية، في وجود تكوين المصفوفة خارج الخلوية النوعية للنسيج، من وجهة نظري. كما تتميز السقالة منزوعة الخلايا عن طريق التروية بالبنية الدقيقة النوعية للنسيج، مثل البنية الوعائية. ويتيح وجود البنية الوعائية إعادة إدخال الخلايا إلى السقالة بشكل أكثر تجانساً.

كما أنها تتيح لنا ترويته بشكل موحد بالمغذيات لتعزيز بقاء الخلايا. وسيقوم نيما، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبرنا، بشرح جزء التباطؤ من البروتوكول. أما جزء إعادة التروية فسوف يقوم بشرحه غابرييل برايس، وهو أيضاً زميل ما بعد الدكتوراه.

يركز عملها على التصنيع الصناعي لهذه الطعوم. لإجراء عملية إزالة الخلايا عن طريق التروية، ابدأ بحصاد كبد جرذ عن طريق قسطرة الوريد البابي. باستخدام قسطرة مقاس 18 gauge، اترك الوريد الأجوف السفلي والعلوي مفتوحين. حافظ على ترطيب العضو في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS في طبق بتري بقطر 10 centimeter.

بعد ذلك، قم بإعداد نظام تروية يتكون من خزان سعة ثمانية لترات، ومضخة تمعجية، ومصيدة فقاعات. املأ نظام التروية بمحلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS واتركه يعمل لمدة 10 دقائق. ثم املأ طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر بمحلول PBS وخفّض معدل تدفق المنظم إلى 1.2 milliliters per minute.

انقل الكبد الذي تم حصاده بعناية إلى طبق بتري يحتوي على PBS واتركه ليتنقع طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بغسل الكبد بـ 0.01% sodium ESAL sulfate أو SDS في ماء مقطر لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم التبديل مرة أخرى إلى PBS لمدة ساعة واحدة. تكرر خطوات التروية بـ SDS وPBS ثلاث مرات إضافية، مع زيادة وقت التروية بـ SDS إلى 10 ثم 15 وأخيراً 20 دقيقة. ثم يتم تروية الكبد بالسلسلة التالية: 0.01%SDS لمدة 24 ساعة.

0.1%SDS لمدة 24 ساعة. 0.2%SDS لمدة ثلاث ساعات، 0.5%SDS لمدة ثلاث ساعات. ماء مقطر لمدة 15 دقيقة، 1%Triton X 100 في ماء مقطر لمدة 30 دقيقة، وذلك لإزالة أي أحماض نووية مرتبطة.

وأخيراً، يتم استخدام PBS لمدة ساعتين، وهو ما سيعمل على غسل مصفوفة الكبد منزوعة الخلايا (DLM) بعد اكتمال عملية التروية إذا رغبنا في ذلك، ثم استئصال جميع الفصوص باستثناء الفص الأوسط. تُحفظ مصفوفة DLM في طبق بتري نظيف ومحكم الغلق في PBS عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين موعد استخدامها؛ ولتعقيم مصفوفة DLM، يتم غسلها باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1% per acetic acid و 4% ethanol، ثم تُحضن لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، يتم غسل الـ DLM بمحلول PBS معقم مرتين. ثم يُغسل بمحلول PBS يحتوي على 2% بنسلين ستريبتومايسين، 10 micrograms per milliliter، جنتاميسين و 2.5 micrograms per milliliter، أمفوتيريسين B. يُحفظ الكبد منزوع الخلايا في المحلول نفسه عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين موعد استخدامه في تجارب الـ ization.

ثانياً، لإعادة استزراع مصفوفة كبد منزوعة الخلايا تحت غطاء استزراع الأنسجة. ابدأ باستخدام نظام تروية مشابه للنظام المستخدم في عملية نزع الخلايا من الكبد. املأ نظام التروية بـ 200 milliliters من وسط الاستزراع، مثل DMEM عالي الجلوكوز، و10% fetal bovine serum، و100 units per milliliter من البنسلين، و100 micrograms per milliliter من الستريبتومايسين.

ضع كبد الفأر المنزوع (DLM) في غرفة التروية وقم بتوصيله بنظام التروية عبر كانيولا الوريد البابي بينما تعمل المضخة بمعدل 5 ml/min. ولتجنب تكون أي فقاعات هوائية، اترك الوسط يروي الـ DLM لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، أوقف التدفق في نظام التروية واحقن ببطء 50 مليون خلية كبدية معزولة من جرذ بالغ في نظام التروية عبر مصيدة الفقاعات.

أعد تشغيل التدفق بمعدل 10 milliliters per minute وأعد تدوير الوسط لمدة 10 minutes. أوقف تدفق الوسط مرة أخرى. ثم احقن 50 million إضافية من الخلايا الكبدية (hepatocytes).

بعد ذلك، أعد تشغيل التدفق مرة أخرى بمعدل 10 milliliters لكل دقيقة. كرر هذا الإجراء حتى يتم إدخال إجمالي 200 million من الخلايا الكبدية في الـ DLM. بمجرد حقن جميع الخلايا في الـ DLM، اجمع المادة الناتجة في أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 800 RPM لمدة خمس دقائق.

تخلص من السوائل الطافية واجمع الرواسب في أنبوب واحد. حدد عدد الخلايا ومدى حيويتها باستخدام طريقة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء. وذلك لتحديد كفاءة استزراع الخلايا.

عملية إزالة الخلايا من طعم كبدي. قم بإعداد نظام تروية معقم يتضمن جهازاً لإمداد الأكسجين. املأ نظام التروية بـ 50 milliliters من وسط زراعة مثل Williams E مع 5%PBS، و 0.5 units per milliliter من الإنسولين.

20 nanograms per milliliter من EGF، و14 nanograms per milliliter من الجلوكاجون، و7.5 micrograms per milliliter من الهيدروكورتيزون، و100 units per milliliter من البنسلين، و100 micrograms per milliliter من الستريبتومايسين. ضع طعم الكبد الخلوي في غرفة التروية وقم بتوصيله بنظام التروية عبر قنية الوريد البابي بينما تعمل المضخة بمعدل خمسة milliliters per minute.

لتجنب تكون أي فقاعات هوائية، أغلق غرفة التروية بطريقة معقمة وأحكم إغلاقها لمنع أي تسرب أثناء الزراعة. قم بتحضين نظام التروية عند 37 °C مع 10% carbon dioxide وزد معدل تدفق التروية إلى 15 milliliters per minute. صِل جهاز الأكسجة بخزان مزيج غازي يتكون من 95% oxygen و 5% carbon dioxide، واضبط معدل تدفق الغاز على 0.5 liters per minute.

من شأن ذلك أن يحقق ضغطًا جزئيًا للأكسجين يبلغ حوالي 400 مليمتر زئبق. استمر في الزراعة لمدة تصل إلى 10 أيام مع تغيير وسط الزراعة يوميًا. يتم أخذ عينات من الوسط يوميًا لقياس إفراز الألبومين واليوريا وحمض الصفراوي الكلي لمراقبة وظائف الكبد للطعم في نهاية فترة الزراعة.

قم بأخذ عينات من طعم الكبد منزوع الخلايا لإجراء التحليلات الجزيئية والنسيجية. تستغرق عملية إزالة الخلايا الكاملة لكبد الجرذ حوالي 72 ساعة، وذلك باستخدام البروتوكول الموصوف.

تحتفظ المصفوفة الناتجة بنسبة 100% من الكولاجين الليفي، و50% من الجليكوأمينوجليكانات، و5% فقط من الحمض النووي DNA للكبد الأصلي. كما يتم الحفاظ على البنية الوعائية للمصفوفة، كما يتضح من تحليل صب التآكل والمجهر الإلكتروني الماسح. ويسهل وجود البنية الوعائية الدقيقة داخل مصفوفة الكبد منزوعة الخلايا (DLM) إعادة استيطانها بالخلايا بكفاءة تصل إلى 96% ومن ثم ترويتها.

بالنسبة للزراعة في المختبر، يمكن زراعة طعم الكبد لمدة تصل إلى 10 أيام في المختبر، وتظهر وظائف كبدية سليمة كما تم التأكد من ذلك عبر إفراز albumin و urea وإجمالي الأحماض الصفراوية. لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الخلايا وإعادة بناء الكبد بالكامل.