اختبار للقياس الكمي للبولي فوسفات غير العضوي في البكتيريا

بولي فوسفات غير عضوي (polyP) هو بوليمر فوسفات خطي يشارك في الفوعة البكتيرية والاستجابة للإجهاد ، ويتم تخزينه على شكل حبيبات سيتوبلازمية.

لتحديد كمية polyP ، خذ صفيحة متعددة الآبار بتركيزات متزايدة من معايير الفوسفات غير العضوية.

أضف مستخلص بولي P البكتيري المنقى إلى بئر فارغ.

أدخل عازلة تفاعل تحتوي على إنزيم إكسوبولي فوسفاتيز لكل بئر واحتضانها.

يشق الإنزيم polyP إلى فوسفات غير عضوي حر ، ويحوله إلى شكل قابل للقياس الكمي.

أضف كاشف الكشف الذي يحتوي على الموليبدات وحمض الأسكوربيك واحتضانه.

يتفاعل الموليبدات مع الفوسفات لتكوين مجمعات الفوسفوروموليبدات ، والتي يتم تقليلها بواسطة حمض الأسكوربيك إلى مجمعات زرقاء اللون.

قياس امتصاص المركب الملون. يتوافق الامتصاص المقاس مع شدة اللون الأزرق الذي يتناسب طرديا مع تركيز الفوسفات.

قم بإنشاء المنحنى القياسي وحساب مستويات الفوسفات في العينة ، مما يعكس محتوى polyP الأصلي للبكتيريا.

ابدأ بإعداد معايير تحتوي على صفر أو خمسة أو 50 أو 200 ميكرومولار فوسفات البوتاسيوم في 50 ملليمولار درجة الحموضة ثمانية تريس هيدروكلوريد.

Aliquot 100 ميكرولتر من كل معيار فوسفات و 100 ميكرولتر من عينات polyP المستخرجة في آبار منفصلة من صفيحة 96 بئر واضحة. قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي ، لكل عينة ، على 30 ميكرولتر من عازلة تفاعل 5X ScPPX ، و 19 ميكرولتر من الماء ، وميكرولتر واحد من ScPPX المنقى. أضف 50 ميكرولترا من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة البئر 96.

واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في يوم الكشف ، قم بإعداد مخزون عمل جديد من محلول الكشف عن طريق خلط 9.12 مل من قاعدة محلول الكشف مع 88 مل من حمض الأسكوربيك المولي ، واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. أضف 50 ميكرولترا من محلول الكشف إلى كل عينة ومعايير في لوحة البئر 96.

للسماح بتطوير اللون ، احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين تقريبا. استخدم قارئ الألواح لقياس الامتصاص عند 882 نانومتر وحساب تركيز الفوسفات لكل عينة بالمقارنة مع منحنى فوسفات البوتاسيوم القياسي. ثم قم بتحويل تركيزات الفوسفات إلى نانومول من الفوسفات المشتق من polyP في كل خلية تحلل وتطبيع محتوى polyP الخلوي إلى بروتين خلوي كلي ، كما هو موضح في المخطوطة.