إجراء لحصاد البكتيريا والتحلل الميكانيكي

خذ مزرعة المكورات العنقودية الذهبية ، وهي بكتيريا ذات جدار خلية ببتيدوغليكان سميك.

قم

بتخفيف المزرعة في وسط جديد يحتوي على مضادات حيوية واحتضانها في درجة حرارة دافئة مع الرج لتعزيز نمو البكتيريا.

انقل المزرعة إلى أنبوب وقم بطردها المركزي لحبيبات البكتيريا.

تخلص من المادة الطافية وضع الحبيبات على الجليد لحماية البكتيريا من التلف.

أعد تعليق الحبيبات في محلول التحلل وانقلها إلى أنبوب يحتوي على حبات السيليكا.

أدخل الأنبوب في أداة تحلل الخلية الميكانيكية وابدأ التحريض.

تولد

الاصطدامات السريعة بين البكتيريا والخرز قوى قص. يؤدي هذا إلى تحلل البكتيريا ، وإطلاق مجمعات الحمض النووي والحمض النووي الريبي وبروتين الحمض النووي الريبي.

تعمل

الأيونات الموجودة في المخزن المؤقت للتحلل على استقرار هياكل الحمض النووي الريبي ، بينما تعمل العوامل المختزلة في المخزن المؤقت على تعطيل الإنزيمات المهينة للحمض النووي الريبي.

الآن ، قم بالطرد المركزي للخليط مرة أخرى لتكسير الحطام.

اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات لمزيد من التحليل.

قم بزراعة مستعمرة واحدة من السلالات التي تحمل إما pCN51 أو P3 أو MS2 sRNA أو pCN51 P3 MS2 البلازميدات في ثلاثة ملليلتر من وسط BHI مع استكمال 10 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الإريثروميسين في نسخ مكررة.

قم بتخفيف كل مزرعة ليلية في 50 مل من وسط BHI الطازج المكمل بالإريثرومايسين للوصول إلى OD 600 من 0.05. قم بزراعة المزارع عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 180 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات. انقل كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2 ، 900 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية ، وقم بتجميدها وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر أو احتفظ بالكريات على الجليد وقم بإجراء تحلل الخلايا الميكانيكية مباشرة.

لإجراء تحلل الخلايا الميكانيكية ، قم بتعليق الكريات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت A ونقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مع 3.5 جرام من حبات السيليكا. أدخل الأنابيب في أداة تحلل الخلية الميكانيكية وقم بتشغيل دورة مدتها 40 ثانية بسرعة أربعة أمتار في الثانية. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2,900 مرة G لمدة 15 دقيقة ، ثم استرجع المادة الطافية واحتفظ بها على الجليد.

تأكد من أن المادة الطافية واضحة ، وكرر الطرد المركزي إذا لم يكن كذلك.